Journal of New Medical TechnologiesJournal of New Medical TechnologiesВестник новых медицинских технологий1609-2163146010.12737/2748Медицинская биофизика и разработка лечебно-диагностической аппаратурыMedical Biophysics and Development of Treatment‐and‐Diagnostic EquipmentМедицинская биофизика и разработка лечебно-диагностической аппаратурыExperimental Complete Transection Spinal Cord and Its Bioengineering ReconstructionЭкспериментальная полная транссекция спинного мозга и его биоинженерная реконструкцияКаптюкГ. И.KaptyukG. И.ИгнатовА. В.IgnatovA. В.КузнецовВ. А.KuznetsovV. А.ШеинаЮ. И.SheinaYu. И.БольшаковИ. Н.BolshakovI. Н.КарапетянА. М.KarapetyanA. М.1012201310122013204130138https://zh-szf.ru/en/nauka/article/1460/view
Работа представляет оригинальное исследование, посвященное клеточной и тканевой реконструкции повреждения спинного мозга у взрослых крыс с экспериментальной позвоночно-спинальной травмой. После выполнения лами-нэктомии, частичного и полного механического пересечения спинного мозга на уровне IX грудного позвонка в дефект спинного мозга имплантировано изделие медицинского назначения, содержащее бычий коллаген и крабовый хитозан, сульфатирован-ные и несульфатированные гликозаминогликаны, полную питательную среду, кондиционированную питательную среду с ней-ротрофическими факторами роста от клеток головного мозга эмбрионов мышей и эмбриональных стволовых клеток мыши, N2 нейрональную добавку, ретиноевую кислоту. Динамический неврологический статус животных показал существенное сокращение дефицита по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции в течение 20 недель постимплантационного периода. Метод иммунофлуоресценции клеток диспергатов спинного мозга и гистологических срезов подтверждает присутствие активного внедрения клеток спинного мозга крысы в имплантат, высокую жизнеспособность трансплантированных предшественников нейрональных клеток мыши в течение всего периода наблюдения, формирование через 1 неделю после трансплантации клеток нейрональной ткани с экспрессией медиаторов передачи нервного сигнала. Эти изменения в контроле сопровождаются частичным восстановлением двигательной, сенсорной и вегетативной функции спинного мозга, сокращением уровня нейродефицита, равного 5.6 баллов по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции. Трансплантация коллаген-хитозановой матрицы, содержащей 100 тыс. клеток - нейрональных предшественников приводит в течение 20 недель наблюдения к сохранению их жизнеспособности, формированию многочисленных нейронов, образующих межсинаптические связи, ранней экспрессии нейротрансмиттеров, существенным восстановлением нарушенных двигательных и чувствительных функций спинного мозга, достигая уровня сокращения нейродефицита, равного 19.5 баллов по шкале оценки выраженности неврологического дефицита при полной транссекции.
The work represents the original research devoted to cellular and issue reconstruction of a spinal cord injury in adult rats with an experimental vertebral-spinal trauma. After performing a laminectomy, partial and full mechanical intersection of the spinal cord at the IX thoracic vertebrae in the spinal implanted medical devices containing bovine collagen and crab chitosan, sulfated and non-sulfated glycosaminoglycans, full nutrient medium, conditioned nutrient medium with neurotrophic factors in the growth of brain cells mouse embryos and embryonic mouse stem cells, N2 neuronal additive, retinoic acid. The dynamics neurologic status in animals has shown essential reduction of deficiency on BBB scale during 20 weeks of the postoperative period. The indirect immune-fluorescence method of a spinal cord cells and histological sections confirms presence of active introduction of cells of a parent spinal cord into implant, high viability of the replaced cells of the mouse during all period of supervision, formation in 1 week after operation of progenitor neuronal cells with expression of neurotransmitters. This change is accompanied by a partial recovery of motor, sensory and vegetative functions of the spinal cord, reduction in the level of neuro-deficit of 5, 6 points on a scale of BBB. Transplantation of collagen-chitosan matrix containing 100 thousand cells, neuronal precursors leads for 20 weeks of observation to preserve their viability, formation of numerous neurons, creating intra-synaptic correlation associated to early expression of neurotransmitters, significant restoration of motor and sensory functions of the spinal cord, reaching a level of reduction neuro-deficit equal to 19.5 points on a scale of BBB.
Стандарт первичной хирургической обработки осложненной позвоночно-спинальной травмы не предусматривает реконструкцию спинного мозга, включает выполнение операции укрепления позвонков и стабилизацию позвоночника относительно спинного мозга. В экспериментальной практике при постановке задачи реконструкции спинного мозга при его повреждении используют аутологичные, аллогенные или ксеногенные стволовые клетки, выделенные и культивированные из костного мозга, жировой ткани, периферической крови и других мест дислокации. При этом имплантация клеток осуществляется либо в свободном виде в качестве инъекции в место дислокации травмы спинного мозга или субарахноидально, либо клетки помещаются в гидрогелевую основу и в таком виде вводятся в место травмы после оперативного доступа через костные элементы позвоночника и обнажения спинного мозга. Результаты таких манипуляций малоудовлетворительны, характеризуются далеко неполной положительной неврологической динамикой, слабым морфологическим контролем реконструкции. Проблема спинальной травмы состоит в отсутствии эффективных сертифицированных методов реконструкции миеломаляционных очагов при спинальной травме с восстановлением анатомической и функциональной целостности проводящих путей. Предлагаемые методы реконструкции предусматривают использование нейронов в питательных средах, в том числе полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСКч). Использование дифференцированных дериватов недостаточно эффективно по причине их низкой массы, непродолжительной жизнеспособности, большой потери при трансляции с подложек в дислокацию травмы. Известны различные протоколы получения дифференцированных дериватов нейрональных клеток из стволовых клеток. В этих протоколах для переноса клеток с культуральных флаконов используют растворы энзимов (трипсина, коллагеназы, дес-пазы и т.п.). Эти манипуляции приводят к увеличению уровня апоптоза, клеточной гибели, повреждению поверхностных клеточных рецепторов [5]. Создание и испытание биоде-градируемых матриц, создающих благоприятные условия для культивирования и дифференцировки ЭСК, является весьма востребованной задачей. Возможность регенерации проводящих путей спинного мозга (СМ) существенно ограничена в связи с необратимыми морфологическими изменениями в нервной ткани после повреждения, особенно в кау-дальной ее части. За последнее время накоплены важные экспериментальные данные и ограниченный клинический материал, свидетельствующий о принципиальной возможности регенерации в центральной нервной системе (ЦНС) и возможном восстановлении ее нарушенных функций в течение достаточно длительного времени, несмотря на применение модели с полным пересечением спинного мозга у экспериментальных животных [15,20,29]. Полученные научные факты позволяют предложить новые стратегии и концепции лечения повреждений СМ. Основным инструментом регенеративной медицины являются различные клеточные технологии от трансплантации клеток (клеточная терапия) до тканевой инженерии. В этом смысле речь идет о введении нейрональных клеток или их предшественников при травматическом повреждении СМ в его микроокружение на основе трехмерных биодеградируемых подложек. Перспективным направлением в регенераторной клеточной терапии можно считать трансплантацию предшественников нейрональных клеток или нейрональных стволовых клеток (НСК), которые получают из нейроэпителия эмбриона. Направленное культивирование СК приводит к их нейрональной дифференци-
Применение полисахаридной нейрональной матрицы при лечении экспериментальной спинальной травмы / И.Н. Большаков [и др.]// Вопросы реконструктивной и пластической хирургии- 2012- Т. 15.- №1.- С. 34^12.
Bol´shakov IN, Eremeev AV, Svetlakov AV, Sheina Yul, Rendashkin IV, Polstyanoy AM, et al. Primenenie polisakharid-noy neyronal´noy matritsy pri lechenii eksperimental´noy spinal´noy travmy. Voprosy rekonstruktivnoy i plasticheskoy khirur-gii. 2012;15(l):34-42. Russian.
Коллаген-хитозановая матрица для культивирования и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в клетки нейрональной природы. Маркерный анализ / И.Н. Большаков [и др.]// Фундаментальные исследования- 2012 - №1.- С. 18-23.
Bol´shakov IN, Eremeev AV, Sheina Yul, Polstyanoy AM, Karapetyan AM, Ignatov AV, et al. Kollagen-khitozanovaya matritsa dlya kul´tivirovaniya i differentsirovki embrional´nykh stvolovykh kletok v kletki neyronal´noy priro-dy. Markernyy analiz. Fundamental´nye issledovaniya. 2012;1:18-23. Russian.
Трансплантация клеточной полисахаридной подложки при частичном спинальном разрыве у крыс. Динамический неврологический контроль / И.Н. Большаков [и др.] // Фундаментальные исследования- 2012- №2 - С. 31-34.
Bol´shakov IN, Krivopalov VA, Kaptyuk GI, Karapetyan AM, Ignatov AV. Transplantatsiya kletochnoy polisakharidnoy podlozhki pri chastichnom spinal´nom razryve u krys. Dinami-cheskiy nevrologicheskiy kontrol´. Fundamental´nye issledovaniya. 2012;2:31-4. Russian.
Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген-хитозановой матрице / А.В. Еремеев [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия - 2009.- № 4.- С. 55-62.
Eremeev AV, Svetlakov AV, Bol´shakov IN, Vlasov AA, Arapova VA. Funktsii kul´tiviruemykh embrional´-nykh kletok na kollagen-khitozanovoy matritse. Kletochnaya transplantolo-giya i tkanevaya inzheneriya. 2009;4:55-62. Russian.
Жизнеспособность и функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях / А.В. Еремеев [и др.] // Сиб. мед.обозрение.- 2008.- №6.- С. 24-27.
Eremeev AV, Svetlakov AV, Bol´shakov IN, Vla-sov AA, Arapova VA. Zhiznesposobnost´ i funktsii plyuripotent-nykh kletok i fibroblastov dermal´no-epidermal´nogo sloya zhivotnykh v usloviyakh ikh kul´tivirovaniya na kollagen-khitozanovykh pokrytiyakh. Sib. med.obozrenie. 2008;6:24-7. Russian.
Andrews, M.R. Evaluation of olfactory ensheathing and Schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord / D.J. Andrews, D.J. Stelzenr // J. Neurotrauma - 2007.- V.24- P. 1773-1792.
Andrews MR, Stelzenr DJ. Evaluation of olfactory en-sheathing and Schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J. Neurotrauma. 2007;24:1773-92.
Basso, D.M. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats / D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // J. Neurotrauma.- 1995.- V.12.- P. 1-21.
Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J. Neurotrauma. 1995;12:1-21.
Baumann, M.D. Intrathecal delivery of a polymeric na-nocomposite hydrogel after spinal cord injury / M.D. Baumann, C.E. Kang, C.H. Tator, M.S. Shoichet // Biomaterials.- 2010.-V.31.-P. 7631-7639.
Baumann MD, Kang CE, Tator CH, Shoichet MS. Intra-thecal delivery of a polymeric nanocomposite hydrogel after spinal cord injury. Biomaterials. 2010;31:7631-9.
Cheng, H. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury / H. Cheng, Y.C. Huang, P.T. Chang, Y.Y. Huang// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2007.- V. 357.- P.938-944.
Cheng H, Huang YC, Chang PT, Huang YY. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007;357:938-44.
Survival and migration of human and rat olfactory ensheathing cells in intact and injured spinal cord / C. Deng [et al.] // J. Neurosci. Res.- 2006.- V.83.- P.1201-1212.
Deng C, Gorrie C, Hayward I, Elston B, Venn M, Mackay-Sim A, Waite P. Survival and migration of human and rat olfactory ensheathing cells in intact and injured spinal cord. J. Neurosci. Res. 2006;83:1201-12.
Eremeev, A.V. Patent RU. 2010. Method for producing a neural matrix / A.V. Eremeev, A.V. Svetlakov, I.N. Bol´shakov, Ju.I. Sheina, A.M. Polstyanoy. PCT/ RU2011/000213 № WO/2011/142691.
Eremeev AV, Svetlakov AV, Bol´shakov IN, Sheina Jul, Polstyanoy AM, inventors. Method for producing a neural matrix Russian Federation patent RU. WO/2011/142691. 2010. Russian.
Fitch, M.T. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure / M.T. Fitch, J. Silver // Exp Neurol.- 2008.- V.209.- P.294-301.
Fitch MT, Silver J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 2008;209:294-301.
Franssen, E.H.P. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord / E.H.P. Franssen, F.M. de Bree, J. Verhaagen // Brain Res. Rev.- 2007.- V.56.- P.236-258.
Franssen EHP, de Bree FM, Verhaagen J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 2007;56:236-58.
Gros, T. Regeneration of long-tract axons through sites of spinal cord injury using templated agarose scaffolds / T. Gros, J.S. Sakamoto, A. Blesch, L.A. Havton, M.H. Tuszynski // Biomaterials.- 2010.- V.31.- P. 6719-6729.
Gros T, Sakamoto JS, Blesch A, Havton LA, Tuszynski MH. Regeneration of long-tract axons through sites of spinal cord injury using templated agarose scaffolds. Biomaterials. 2010;31:6719-29.
Poly(D,L-lactic acid) macroporous guidance scaffolds seeded with Schwann cells genetically modified to secrete a bi-functional neurotrophin implanted in the completely transected adult rat thoracic spinal cord / A. A. Hurtado [et al.] // Biomaterials.- 2006.- V.27.- P.430^42.
Hurtado A, Moon LD, Maquet V, Blits B, Jer rome R, Oudega M. Poly (D,L-lactic acid) macroporous guidance scaffolds seeded with Schwann cells genetically modified to secrete a bi-functional neurotrophin implanted in the completely transected adult rat thoracic spinal cord. Biomaterials. 2006;27:430-42.
Li, X. The effect of neurotrophin-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells / X. Li, Z. Yang, A. Zhang // Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.4978-4985.
Li X, Yang Z, Zhang A. The effect of neurotrophin-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells. Biomaterials. 2009;30:4978-85.
Li, X.G. Studies on repairing of hemisected thoracic spinal cord of adult rats by using a chitosan tube filled with alginate fibers / X.G. Li, Z.Y. Yang, Y. Yang // Prog. Nat. Sci.-2006.- V.16.- P.1051-1055.
Li XG, Yang ZY, Yang Y. Studies on repairing of he-misected thoracic spinal cord of adult rats by using a chitosan tube filled with alginate fibers. Prog. Nat. Sci. 2006;16:1051-5.
Li, X.G. Repair of thoracic spinal cord injury by chitosan tube implantation in adult rats / X.G. Li, Z.Y. Yang, A.F.Zhang, T.L. Wang, W.C. Chen// Biomaterials.- 2009.-V.30.-P.1121-1132.
Li XG, Yang ZY, Zhang AF, Wang TL, Chen WC. Repair of thoracic spinal cord injury by chitosan tube implantation in adult rats. Biomaterials. 2009;30:1121-32.
Olfactory ensheathing cells do not exhibit unique migratory or axonal growth-promoting properties after spinal cord injury / P. Lu [et al.] // J. Neurosci.- 2006.- V.26.- P.11120-11130.
Lu P, Yang H, Culbertson M, Graham L, Roskams AJ, Tuszynski MH. Olfactory ensheathing cells do not exhibit unique migratory or axonal growth-promoting properties after spinal cord injury. J. Neurosci. 2006;26:11120-30.
Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration / M.J. Moore [et al.] // Biomaterials- 2006 - V.27.- P.419^29.
Moore MJ, Friedman JA, Lewellyn EB, Mantila SM, Krych AJ, Ameenuddin S, et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 2006;27:419-29.
Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury / S. Okada [et al.] // Nat. Med.- 2006.- V.12.- P.829-834.
Okada S, Nakamura M, Katoh H, Miyao T, Shimazaki T, Ishii K, Yamane J, Yoshimura A, Iwamoto Y, Toyama Y, Okano H. Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury. Nat. Med. 2006;12:829-34.
In vitro behavior of neural stem cells in response to different chemical functional groups / Y.-J. Ren [et al.]// Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.1036-1044.
Ren Y-J, Zhang H, Huang H, Wang X-M, Zhou Z-Y, Cui F-Z, An Y-H. In vitro behavior of neural stem cells in response to different chemical functional groups. Biomaterials. 2009;30:1036-44.
Thuret, S. Therapeutic interventions after spinal cord injury / S. Thuret, L.D.F. Moon, F.H. Gage // Nat. Rev. Neurosci.- 2006.- V.7.- P.628-643.
Thuret S, Moon LDF, Gage FH. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2006;7:628-43.
Induced pluripotent stem cells for neural tissue engineering / A. Wang [et al.]// Biomaterials.- 2011.- V.32.- P. 5023-5032.
Wang A, Tang Z, Park I-H, Zhu Y, Patel S, Daley GQ, Li S. Induced pluripotent stem cells for neural tissue engineering. Biomaterials. 2011;32:5023-32.
Wang, D.D. The astrocyte odyssey / D.D. Wang, A. Bordey // Progress in Neurobiol.- 2008.- V.86.- P.342-367.
Wang DD, Bordey A. The astrocyte odyssey. Progress in Neurobiol. 2008;86:342-67.
Cograft of neural stem cells and schwann cells over-expressing TrkC and neurotrophin-3 respectively after rat spinal cord transaction / J.-M. Wang [et al.] // Biomaterials- 2011 - V.32.- P.7454-7468.
Wang J-M, Zeng Y-S, Wu J-L, Li Y, Teng YD. Cograft of neural stem cells and schwann cells overexpressing TrkC and neurotrophin-3 respectively after rat spinal cord transection. Biomaterials. 2011;32:7454-68.
Clinical observation of fetal olfactory ensheathing glia transplantation (OEGT) in patients with complete chronic spinal cord injury / J. Wu [et al.] // Cell Transplantation- 2012.- V.21.-P.33-37.
Wu J, Sun T, Ye C, Yao J, Zhu B, He H. Clinical observation of fetal olfactory ensheathing glia transplantation (OEGT) in patients with complete chronic spinal cord injury. Cell Transplantation. 2012;21:33-7.
Synaptic transmission of neural stem cells seeded in 3-dimensional PLGA scaffolds / Yi. Xiong [et al.]// Biomaterials.- 2009.- V.30.- P.3711-3722.
Xiong Yi, Zeng Y-S, Zeng C-G, Du B-ling, He L-M, Quan D-P, Zhang W, Wang J-M, Wu J-L, Li Y, Li J. Synaptic transmission of neural stem cells seeded in 3-dimensional PLGA scaffolds. Biomaterials. 2009;30:3711-22.
Yang, Z. The effect of the dosage of NT-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells / Z. Yang, H. Duan, H. Mo, H. Qiao, X. Li // Biomaterials.-2010.- V.31.- P. 4846-854.
Yang Z, Duan H, Mo L, Qiao H, Li X. The effect of the dosage of NT-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells. Biomaterials. 2010;31:4846-54.
Yiu, G. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nature reviews / G. Yiu, Z.G. He // Neuroscience- 2006- V.7.- P. 617-627.Yiu G, He ZG. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 2006;7:617-27.