Бронхоспазм в ответ на физическую нагрузку (БФН) регистрируется у значительной части больных бронхиальной астмой (БА) и тесно связан с тяжестью и низким контролем заболевания [4, 23]. В основе его формирования лежит увеличение респираторных тепло- и влагопотерь вследствие гипервентиляции, поддерживаемой в течение физической нагрузки [25]. Возникающая в результате избыточной влагопотери с поверхности слизистой гиперосмолярность жидкости, покрывающей дыхательные пути, индуцирует нарастание внутриклеточной концентрации ионов Na+ и Сl– [23]. Пассивно следующий за Сl– внутрь тучных клеток Са2+ вызывает их дегрануляцию и высвобождение провоспалительных медиаторов и бронхоконстрикторов – гистамина, лейкотриенов и простагландинов [23].Поддержание бронхообструкции происходит за счёт эскалации оксидативного стресса, образования активных форм кислорода (АФК) и галогенсодержащих реагентов – активных форм галогенов (АФГ), приводящих к необратимым изменениям биологически важных молекул – белков, липидов, нуклеиновых кислот – и разрушению биомембран [6, 7, 9, 12]. АФГ, в частности, ионизированная форма хлорноватистой кислоты (НОCl) – гипохлорит, наряду с АФК, способны модифицировать активность ядерного транскрипционного фактора NF-kВ с последующей стимуляцией экспрессии генов провоспалительных цитокинов [20]. Окислительное повреждение белков и гликопротеинов, реализуемое АФГ, модифицирует активность клеточных рецепторов и активирует окислительно-восстановительные и гидролитические ферменты [7]. В результате реакций окисления галогенидов развивается перекисное окисление липидов (ПОЛ) [7], ассоциированное с прогрессированием воспалительной экссудации и инфильтрации бронхиальной паренхимы [6]. Так, увеличение концентрации метаболитов ПОЛ в конденсате выдыхаемого воздуха и сыворотке крови у больных БА с осмотической гиперреактивностью дыхательных путей причастно к утяжелению бронхоконстрикторной реакции на экзогенные стимулы и потере контроля над заболеванием [8].Генераторами окислительных процессов, эффекторами воспаления и продуцентами миелопероксидазы (МПО) – катализатора образования АФГ и свободных радикалов – являются гранулярные лейкоциты: нейтрофилы и эозинофилы, принимающие непосредственное участие в центральных процессах патогенеза БА – воспаления и оксидативного стресса. Поскольку постнагрузочный бронхоспазм характеризуется эозинофильным типом воспаления, сопровождаясь гиперпродукцией эозинофилами дыхательных путей мощных бронхоконстрикторов – цистеиниловых лейкотриенов [1, 14], в проблеме исследования БФН у больных БА наибольший интерес представляют инфильтрирующие бронхи эозинофилы. Значение структурной организации эозинофильного звена воспаления бронхов, ферментативной функции эозинофилов, а также влияние оксидантной активности МПО и процессов липопероксидации в формировании патологической реакции дыхательных путей на физическую нагрузку мало исследованы.Целью настоящей работы явилось изучение роли структурно-функционального профиля эозинофильного компонента бронхиального воспаления и уровня пероксидации в развитии у больных БА бронхоспазма в ответ на дозированную физическую нагрузку (ДФН). Материалы и методы исследования В исследовании приняли участие 57 больных, в возрасте от 22 до 55 лет (39,7±1,7 лет), обоего пола (36 женщин, 21 мужчин), с лёгким персистирующим, частично контролируемым и неконтролируемым течением БА в соответствии с GINA [17], и 20 практически здоровых лиц, вошедших в контрольную группу. Пациенты подписывали информированное согласие на участие в клиническом исследовании в соответствии с протоколом, одобренным локальным Комитетом по биомедицинской этике Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания.Критериями включения пациентов в исследование служили: ОФВ1 более 75% должной величины, отсутствие острой респираторной инфекции в течение последних 4 недель, сопутствующей патологии других органов и систем, которая могла отрицательно повлиять на результаты обследования, отсутствие общих противопоказаний для проведения функциональных и лабораторных процедур. На момент включения в исследование пациенты принимали низкие и средние суточные дозы ингаляционных кортикостероидов (≤1000 мкг в перерасчёте на бекламетазон) в виде монотерапии или в сочетании с длительно действующими β2-агонистами и короткодействующие β2-агонисты в режиме «по требованию» в течение предшествующих 4 недель.Критерием включения здоровых лиц служило отсутствие острой респираторной инфекции за последние 4 недели, сопутствующей острой патологии других органов и систем, влияющей на результаты обследования, ни один из них не принимал каких-либо лекарственных препаратов в предыдущие 2 недели до предстоящего тестирования. Обследованные из этой группы имели нормальные значения вентиляционной функции лёгких: форсированная жизненная ёмкость лёгких (ФЖЕЛ) составила в среднем 102,1±1,08% от должной; объем форсированного выдоха за 1 сек (ОФВ1) – 103,4±2,58% от должного, отношение ОФВ1/ЖЕЛ − 101,4±1,18% от должного.Дизайн исследования включал клинико-анамнестическое тестирование больных с оценкой контроля над заболеванием по вопроснику Asthma Control Test (АСТ) (Quality Metric Inc., 2002), базовую оценку вентиляционной функции лёгких, проведение бронхопровокационной пробы путём выполнения дозированной физической нагрузки, сбор конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ), получение индуцированной мокроты (ИМ). Во избежание влияния циркадных ритмов на результаты обследования все пациенты проходили тестирование в первую половину дня.Спирометрия выполнялась на аппарате Easy on-PC (nddMedizintechnik AG, Швейцария) с последующей проверкой параметров кривой «поток–объем» форсированного выдоха на обратимый компонент обструкции (DОФВ1, % БЛ) путём ингаляции 200 мкг сальбутамола.С целью создания условий физиологического гиперосмолярного состояния дыхательных путей и выявления постнагрузочного бронхоспазма выполнялось тестирование в острой пробе с дозированной физической нагрузкой [11, 18]. Нагрузка задавалась при помощи тредмила LE 200 CE, включённого в исследовательский комплекс для эргоспирометрических исследований OxyconPro (VIASYS Healthcare, Германия). Режим нагрузки подбирался индивидуально для каждого пациента с учётом пола, возраста, роста и веса. Проба считалась положительной при уменьшении ОФВ1 (DОФВ1, % ДФН) после нагрузки на 10% и более от исходной величины на 1 и 10 минутах восстановительного периода [11, 18].Сбор КВВ выполнялся при помощи аппарата ECoScreen Turbo (VIASUS Healthcare GmbH, Германия), через одноразовый дыхательный контур, который позволял осуществлять вдох из окружающей атмосферы, а выдох – в устройство, конденсирующее пары выдыхаемого воздуха при температуре -20ºC. Температура и относительная влажность окружающего воздуха регистрировались ежедневно перед исследованием, колебания значений показателей находились в пределах 24-25ºС и 55-65%, соответственно. После окончания установленного для сбора КВВ времени колба с биологическим материалом немедленно извлекалась из аппарата, закрывалась крышкой. Жидкий конденсат изымался при помощи стерильного одноразового шприца, немедленно помещался в морозильную камеру при температуре -70ºС, где хранился до проведения биохимических исследований.В образцах КВВ исследовали содержание продуктов ПОЛ по ранее описанной методике [13, 24]. Степень липопероксидации оценивали по Е206 нм – неокисленным липидам, Е233 нм – сопряжённым диенам, Е278 нм – сопряжённым триенам и кетодиенам, выраженным в единицах оптической плотности, а также по соотношению оптической плотности диеновых конъюгатов к неокисленным липидам (Е233/Е206) и отношению оптической плотности сопряжённых триенов и кетодиенов к неокисленным липидам (Е278/Е206). Для работы спектрофотометра и хранения результатов измерения использовали программное обеспечение UV-VIS Analyst.Сбор индуцированной мокроты осуществляли по стандартной методике [15]. Цитологическое исследование микропрепаратов ИМ проводили не позднее 2 часов после её получения при помощи светооптической иммерсионной микроскопии с подсчётом не менее 400 клеток в 100 полях зрения, в центральных и периферических частях мазка. Полученное количество эозинофилов выражали в процентах от общего количества подсчитанных клеток.Активность МПО в эозинофилах ИМ выявляли по методу Грэхема–Кнолля [10] с докраской мазков после обработки бензидином и перекисью водорода водным раствором азура-2. Изображение цитохимических препаратов переводили в цифровую форму с помощью цифровой видеокамеры ДСМ 510 с системой захвата изображения. Для цифровой обработки изображений клеток использовали компьютерные программы Image Tool и Optika Vision Pro (Италия), Mac Biophotonics Image S (США), с учётом полученных данных оптической плотности фермента рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК) МПО в пикселях. Определение степени и интенсивности процессов деструкции и цитолиза эозинофилов ИМ проводили по методу Л.А.Матвеевой [3] с выделением пяти классов деструкции клеток в зависимости от изменений структурной целостности клеточных элементов. Степень повреждения клеток вычисляли с помощью суммарного индекса деструкции клеток (ИДК). Индекс интенсивности цитолиза (ИЦ) рассчитывали как отношение наиболее разрушенных клеток к содержанию остальных повреждённых клеток. Расчёт производился по формулам: ИДК= ; ИЦ= ; где 0, 1, 2, 3, 4 – номера классов деструкции;  – число клеток соответствующего класса.Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики. Для определения достоверности различий использовали непарный критерий t (Стьюдента). С целью определения степени связи между двумя случайными величинами проводили корреляционный анализ, рассчитывали коэффициент корреляции (r). Для всех величин принимались во внимание уровни значимости (р) <0,05. Результаты исследования и их обсуждение Для того чтобы определить влияние структурно-функционального профиля эозинофильного компонента бронхиального воспаления во взаимосвязи с уровнем образования недоокисленных продуктов ПОЛ, был исследован клеточный состав ИМ и процессы липопероксидации в КВВ у больных с постнагрузочным бронхоспазмом (1 группа; 24 человека) и больных, не имевших реакции дыхательных путей на предложенный стимул (2 группа; 33 человека). На момент обследования пациенты сравниваемых групп достоверно не отличались по уровню контроля над заболеванием и базовой функции внешнего дыхания (табл. 1), однако у лиц 1 группы регистрировался достоверно выраженный прирост ОФВ1 в ответ на ингаляцию бронхолитика.Таблица 1Сравнительная клиническая характеристика пациентов (М±m) ПоказателиБольные с постнагрузочным бронхоспазмомБольные с отсутствиемреакции на ДФНpВозраст, лет40,6±2,839,3±1,80,69АСТ, баллы16,3±0,7618,3±0,850,09ОФВ1, % долж.90,0±5,195,4±2,30,28ОФВ1/ЖЕЛ, % долж.85,3±2,6092,7±1,60,016ΔОФВ1, % ДФН-21,1±4,6-0,5±0,640,000001DОФВ1, % БЛ19,6±4,026,5±1,970,002 Примечание: р – достоверность различий между группами больных БА. При сравнении клеточной формулы ИМ оказалось, что процентное число эозинофилов у больных БА обеих исследованных групп было статистически достоверно выше, чем в контроле (0,1±0,08%), с преобладающей тенденцией к увеличению у пациентов с чрезмерной реакцией на ДФН (23,2±4,3, р<0,001 и 16,1±2,9%, р<0,001, соответственно).Как известно, формирование БФН происходит на фоне вовлечения в процесс кондиционирования воздуха периферических дыхательных путей, обладающих наибольшим содержанием тучных клеток [23], коррелирующим с высокой концентрацией в слизистой оболочке эозинофилов и развитием бронхиальной гиперреактивности [16]. Тучные клетки продуцируют и секретируют IL-5, PAF – фактор агрегации тромбоцитов и стимуляции секреции гистамина, LTB4, вызывающий агрегацию и дегрануляцию нейтрофилов, а также активацию лейкоцитов и миграцию нейтрофилов и эозинофилов в очаг воспаления [15]. При этом индуцируется высвобождение эозинофильного катионного протеина (ECP), который, в свою очередь, стимулирует тучноклеточный синтез, секрецию гистамина и простагландина D2 (PGD2), являющегося хемоаттрактантом для эозинофилов и Th2 лимфоцитов посредством связывания рецептора CRTH2 [16, 22]. Таким образом, в литературе эозинофилы рассматриваются не только как продуценты цитотоксичного ECP, разрушающего эпителий бронхов и регулирующего пролиферацию Т- и В-лимфоцитов [16], но и как клетки, обеспечивающие бронхоконстрикторные механизмы. К последним, прежде всего, относится хорошо изученный механизм синтеза эозинофилами цистениловых лейкотриенов (LTС4, LTD4 и LTE4) [1, 14], гиперпродукция которых зарегистрирована в дыхательных путях после физической нагрузки у лиц с развитием постнагрузочного бронхоспазма [19]. Другим механизмом является инициация выработки бронхоконстрикторных медиаторов в результате взаимодействия с тучными клетками [16], насыщающими дыхательные пути дистальнее 12-го порядка (диаметром <1 мм), вовлекающимися в кондиционирование воздуха при возникновении БФН [25].На рост провоспалительной и прооксидантной активности эозинофилов у пациентов с постнагрузочным бронхоспазмом указывала обнаруженная тенденция к увеличению по сравнению со здоровыми внутриклеточной плотности фермента, отражающая усиление синтеза и накопление пероксидазы в гранулах: СЦК МПО составил 103,0±10,6 и 84,8±4,1 пикселей, соответственно (р>0,05). У больных, не ответивших на стимул, СЦК МПО эозинофилов была более низкой – 89,6±8,2 пикселей, практически не отличавшейся от группы контроля (р>0,05). С интенсификацией лизосомального синтеза и внутригранулярного депонирования МПО связаны процессы дегрануляции, деструкции и цитолиза эозинофилов, обеспечивающие персистенцию воспаления и поддержание оксидативного стресса. Выброс фермента во внеклеточную среду направлен на встраивание МПО в оксидативный стресс и конвертацию оксидативного стресса в стресс галогенирующий.Более высокие значения секреторной функциональной активности клеток, морфологически выраженные их деструкцией, обеспечивающей выброс МПО, наблюдались у больных 1 группы, ИДК в которой составил в среднем 0,46±0,03 по сравнению с 0,22±0,06 в группе здоровых лиц (р<0,01). Деструктивные изменения эозинофилов ИМ пациентов 2 группы также превышали контрольные значения ИДК (в среднем 0,44±0,02, р<0,01). Обусловленный чрезмерной активацией ферментов лизосом цитолиз в большей мере, чем деструкция, ассоциируется с воздействием повреждающих факторов, приводящих к нарушению целостности клеточных мембран, изоляцией клетки от её окружения с последующим развитием или прогрессированием воспаления [6]. Следует отметить более активный цитолиз эозинофилов в обеих группах больных (ИЦ в 1 группе 0,31±0,03, р<0,001; во 2 группе 0,31±0,05, р<0,001) по сравнению с контролем (ИЦ в среднем 0,08±0,006).Неоспоримым фактом является сопряжённость пероксидазной активности эозинофилов – синтеза и депонирования МПО, деструкции и цитолиза клеток, ассоциированных с оксидативным и галогенирующим стрессом – с параметрами интенсивности ПОЛ. Важнейшим источником свободных радикалов и индуктором ПОЛ среди продуктов пероксидазного катализа образования АФГ в ходе галогенирующего стресса служит НОCl [7, 21].Концентрация метаболитов ПОЛ в дыхательных путях больных БА, подвергшихся бронхопровокационной пробе с ДФН, может служить объективным свидетельством различий в степени выраженности окислительных процессов и воспаления у лиц противоположными типами реакции бронхов на ДФН (табл. 2).Таблица 2Базовые показатели перекисного окисления липидов в конденсате выдыхаемого воздуха (М±m) ПоказателиБольные с постнагрузочным бронхоспазмомБольные с отсутствием реакции на ДФНКонтрольная группаЕ206 нм0,29±0,04р=0,0080,19±0,010,20±0,03Е233нм0,07±0,007***0,06±0,01***0,03±0,002Е278нм0,01±0,002**0,02±0,005**0,007±0,001Е233/2060,32±0,034*р=0,0460,25±0,0130,22±0,03Е278/2060,057±0,0070,06±0,0060,05±0,01 Примечание: р – достоверность различий между группами больных БА; * – достоверность различий в сравнении с группой контроля. Наряду с обнаруженными изменениями в ИМ у больных, активно реагировавших на ДФН, в КВВ был найден более высокий уровень неокисленных липидов и их окисленных производных. Базовая величина Е206 нм, отражающая содержание неокисленных липидов, у них была существенно выше, чем у больных с отсутствием реакции на ДФН и у здоровых лиц (табл. 2). Аналогичная тенденция была получена и для величины Е233 нм, отражающей содержание диеновых коньюгатов в КВВ, а также индекса окисленности липидов (Е233/Е206) который оказался существенно выше по отношению к больным, не имевшим реакции на ДФН, и здоровым лицам. В ответ на бронхопровокационную пробу происходило увеличение этого показателя, тогда как у больных без БФН и у здоровых лиц наблюдалось отсутствие какой либо динамики Е233/Е206 и Е278/Е206 (рис.).  Рис. Изменение индексов окисленности липидов в конденсате выдыхаемого воздуха у больных БА до и после выполнения дозированной физической нагрузки. Анализируя полученные данные, можно предположить, что у больных БА с постнагрузочным бронхоспазмом в ряду метаболитов ПОЛ дыхательных путей ведущая роль в поддержании более высокого уровня оксидативного и галогенирующего стресса, чем у пациентов с отрицательной пробой ДФН, принадлежит диеновым конъюгатам. Если рассматривать аспект участия МПО и АФГ в процессах ПОЛ, то необходимо обратить внимание на свободнорадикальный механизм взаимодействия первичных АФГ с ненасыщенными связями ацильных цепей фосфолипидов, благодаря которому происходит образование диеновых конъюгатов и гидропероксидов [21]. Гидроперекиси липидов считаются традиционным индикатором ПОЛ в биологических системах. Роль инициирующего звена АФГ-индуцированного ПОЛ отводится реакции НОCl с гидропероксидной группой, всегда содержащейся в том или ином количестве в ненасыщенном липиде в результате его естественного окисления, с образованием пероксильных радикалов, затем трансформирующихся в алкоксильные радикалы [7, 21]. Доказано, что МПО в присутствии своих субстратов (Н2О2 и Cl–) разрушает активированный гидропероксид с образованием О–центрированных радикалов, идентифицированных как пероксильный и алкоксильный [7]. В случае с гидропероксидом жирной кислоты допущена возможность образования, помимо О–центрированных радикалов, некоторого количества синглетного кислорода [7]. Ингибиторный анализ, проведённый с использованием «ловушек» НОCl, перехватчиков свободных радикалов и ингибиторов МПО, показал, что разрушение гидропероксидной группы в присутствии изолированной МПО или активированных лейкоцитов обусловлено непосредственной работой фермента. Это позволило авторам сделать вывод о реально имеющем место зависимом от МПО НОCl-индуцированном ПОЛ [7]. Отсюда следует, что индукция ПОЛ, сопряжённая с интенсивным синтезом и секрецией в экстрацеллюлярное пространство эозинофильной пероксидазы, у астматиков с БФН соответствует современной концепции механизма возникновения избыточной бронхоспастической реакции на основе активации оксидативного стресса, сопровождающегося гиперподукцией АФК, пероксинитрита, гипохлорита [6, 9, 12]. Более высокому уровню Е206, Е233 в КВВ и увеличению индекса Е233/Е206 для диеновых конъюгатов, отражающих мобилизацию процессов свободнорадикального окисления в бронхах, соответствовали наиболее значимые показатели количества эозинофилов, уровней синтеза МПО в азурофильных гранулах клеток и клеточной секреторной активности у больных с БФН.Найденный у больных с БФН морфофункциональный статус с превалированием эозинофильного звена воспаления в бронхах, МПО-зависимым катализом образования АФГ и инициации ПОЛ значимо влиял на степень контроля над заболеванием. У этих больных высокому содержанию эозинофилов в ИМ соответствовали более низкие баллы вопросника АСТ (r=-0,58, р=0,049). Кроме того, у них прослеживалась чёткая связь между реакцией бронхов (ΔОФВ1) на ДФН и базовой концентрацией Е206 (r=-0,39, р<0,01), Е233/Е206 (r=-0,46, р<0,01), Е278/Е206 (r=-0,34, р<0,01), ИЦК эозинофилов в ИМ (r=-0,83, р<0,01).Следовательно, активация эозинофильного компонента воспаления во взаимосвязи с показателями гиперпродукции неокисленных липидов, диеновых конъюгатов в дыхательных путях больных БА могут быть расценены как биомаркеры возможного развития патологической реакции бронхов в ответ на физическую нагрузку. Чем активнее вовлечение в воспалительную инфильтрацию бронхов популяции эозинофилов, чем интенсивнее генерация в дыхательных путях недоокисленных продуктов ПОЛ, тем более неблагоприятным для пациентов становится прогноз развития постнагрузочного бронхоспазма. Выводы У больных БА с постнагрузочным бронхоспазмом в воспалительном инфильтрате дыхательных путей активируется ферментативно-синтетическая и секреторная функция эозинофильного компонента на фоне роста количества популяции эозинофилов.Постнагрузочный бронхоспазм сопровождается интенсификацией процессов образования недоокисленных продуктов ПОЛ в дыхательных путях у больных БА.Структурно-функциональный профиль эозинофильного компонента воспаления и уровень ПОЛ оказывают влияние на формирование реакции дыхательных путей в ответ на физическую нагрузку и маркируют возможность развития данного типа бронхоконстрикции у больных БА. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант №14-25-00019).