Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
Irkutsk, Irkutsk region, Russian Federation
The aim of the research was to determine the features of large intestinal microbiocenosis during the vegetation of bacteria of the genus Klebsiella in children with functional disorders of the gastrointestinal tract in different age periods of the first year of life. The material for the study is based on 210 coprological samples isolated from infants of both sexes with functional disorders of the gastrointestinal tract and indication of Klebsiella spp. in the titer of 105-108 CFU/g. The children were grouped according to the age: 1st − children from 1 to 3 months old, 2nd − children from three to six months old, 3rd − children from 6 to 12 months old. All of them were divided into two groups for comparison, depending on the type of isolated Klebsiella species: K. pneumoniae (n=105) and K. oxytoca (n=105). The investigation of the intestinal microflora was performed in accordance with conventional methodology, and the assessment of the results was done according to Industry Standard. Identified bacteria were divided by their morphologic, tinctorial, cultural and biochemical properties. As a result of the study, dysbiotic disturbances of the 3rd degree were observed in children, complicated by the proliferation of bacteria of the genus Klebsiella, especially by its diagnostically important bacterial agent K. oxytoca. Most critical for the development of functional disorders of the gastrointestinal tract for the children of the first year of life is the age of 3-6 months. Long-term persistence of the Klebsiella spp. in high titer (105-108 CFU/g) in the large intestine of the children with functional disorders of the gastrointestinal tract dictates the need for selective decontamination of the Klebsiella from the gut microbiota.
microflora of the large intestine, Klebsiella spp., functional disorders of the gastrointestinal tract, children of the first year of life
Как известно, первый год жизни ребенка является важным и серьезным этапом в становлении стабильного кишечного микробиоценоза. Процесс становления нормальной бактериальной флоры кишечного биотопа начинается сразу же после рождения ребенка. Основными факторами, обеспечивающими этот процесс у детей, являются: первичная колонизация, толерантность, основные системы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), грудное молоко, пробиотики [11]. Факторами, оказывающими негативное воздействие на формирование микробного фона в толстом кишечнике являются: искусственное вскармливание, лекарственные средства, внутрибольничная среда и др. [1–3, 12]. У грудных детей нормальная бактериальная флора кишечника находится в динамическом равновесии и не вызывает заболеваний. Известно, что в поддержании гомеостаза микробиоценоза толстого кишечника большое значение имеет состояние слизистой оболочки ЖКТ, которая, как и кожа, являясь барьером, отражает негативное воздействие условно-патогенных микроорганизмов (УПМ). Таким образом, при фиксации на эпителии слизистой оболочки толстого кишечника представители нормальной бактериальной флоры образуют пристеночный слой, обеспечивающий колонизационную резистентность организма [9]. Однако, равновесие флоры может нарушаться, и УПМ могут стать причиной патологических процессов, при которых микробиоценоз кишечника будет характеризоваться неустойчивостью, связанной с микробной сукцессией УПМ, приводящей к неадекватному иммунному ответу организма и развитию функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта (ФН ЖКТ) [5]. Нередко цепь таких явлений в кишечнике при ФН ЖКТ замыкается в «порочный круг», в результате которого организм не может без помощи извне выйти из этого состояния [10]. Одним из бактериальных агентов кишечного биоценоза, ломающим защитные механизмы организма, могут быть бактерии рода Klebsiella, обладающие комплексом факторов патогенности, присущих семейству Enterobacteriaceae, и способных за счет этого не только к длительному нахождению в ЖКТ, но и к транслокации в несвойственные биотопы организма хозяина [4]. Klebsiella spp. высеваются из кишечника у детей первого года жизни с ФН ЖКТ с высокой частотой (до 60% случаев), приводя к появлению выраженных микроэкологических нарушений микробиоты кишечника [5].
Цель исследования – установить особенности микробиоценоза толстого кишечника на фоне высокой популяционной плотности бактерий рода Klebsiella у детей с ФН ЖКТ в разных возрастных периодах первого года жизни.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования служили фекалии 210 детей первого года жизни с ФН ЖКТ обоих полов при индикации в них бактерий рода Klebsiella в титре 105-108 КОЕ/г. Бактериальная флора микробиоценоза толстого кишечника, выделенная как у мальчиков, так и у девочек достоверно не отличалась (р>0,05), что позволило их объединить в одну группу (n=210). Дети были распределены по возрасту на следующие группы: первую группу составили дети от 1 до 3 месяцев, вторую группу – дети от 3 до 6 месяцев, в третью группу – дети от 6 до 12 месяцев жизни. Также все обследуемые были разбиты на 2 группы сравнения, в зависимости от вида выделяемых клебсиелл – K. pneumoniae (n=105) и K. oxytoca (n=105). Учитывая, что у здоровых детей Klebsiella spp. в норме может присутствовать в концентрации менее 104 КОЕ/г, сравнение исследуемых групп детей у которых Klebsiella spp. детектируется в концентрации более 105 КОЕ/г с группой здоровых детей было нецелесообразным.
В соответствии с ОСТ (Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». ОСТ 91500.11.0004-2003. Приказ МЗ РФ № 231 от 09.06.2003) у всех детей (n=210) клинически отмечали следующие симптомы: запоры в 14,3% случаев, «неустойчивый» стул в 75,2% случаев. Периодические колики выявлены в 74,8% случаев. Метеоризм часто сопровождал колики и наблюдался у 78,6% детей. Срыгивания после кормления в объеме более 1 чайной ложки (5 мл), повторяющиеся до 5-8 раз в день, встречались у трети наблюдаемых младенцев – в 31,9% случаев.
Исследование проводилось на базе клиники Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека (г. Иркутск). В работе с исследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциацией (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, в редакции, Бразилия, октябрь 2013) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266. Исследования микрофлоры толстого кишечника проводили по стандартной методике, оценка результатов – в соответствии с ОСТ. Выделенные микроорганизмы идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с использованием API-систем «bioMérieux» (Франция).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Excel из пакета MS Office 2007, Statistica 6.1.
Результаты исследования и их обсуждение
Микроэкологический пейзаж кишечника у всех детей с ФН ЖКТ характеризовался нарушениями количественного и качественного состава микроорганизмов толстой кишки, в том числе были обнаружены изменения в составе индигенной микробиоты в зависимости от возрастного периода и видовой принадлежности выделенных штаммов клебсиелл. Оценка резидентной микрофлоры производилась по трем основным интегративным показателям: дефицит бифидобактерий, компенсаторное увеличение титра лактобактерий, диссоциация эшерихий по способности ферментировать лактозу (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика основных представителей индигенной микробиоты толстого кишечника у детей первого года жизни при выделении бактерий рода Klebsiella, %
|
Параметр |
Дефицит бифидобактерий |
Сверхнормативное к-во лактобацилл |
Дефицит E.coli с НФС |
||||||
|
1-3 мес. |
3-6 мес. |
6-12 мес. |
1-3 мес. |
3-6 мес. |
6-12 мес. |
1-3 мес. |
3-6 мес. |
6-12 мес. |
|
|
При выделении K. pneumoniae (n=105) |
93,9 |
95,0 |
30,3 |
97,0 |
100 |
39,4 |
48,5 |
12,8 |
0 |
|
При выделении K. oxytoca (n=105) |
100 |
45,9 |
100 |
100 |
97,3 |
97,0 |
0 |
0 |
15,2 |
С увеличением возраста у детей с ФН ЖКТ при выделении штаммов K. pneumoniae отмечали изменение количественных показателей по всем трём позициям – содержание бифидобактерий, лактобацилл и Escherichia coli с нормальными ферментативными свойствами (НФС) – относительно физиологических нормативов по ОСТу.
При выделении штаммов K. pneumoniae бифидобактерии в концентрации менее 1010 КОЕ/г (дефицит) уменьшалось с 93,9±4,2% у детей первых трех месяцев до 30,3±7,9% случаев к 6-12 месяцам (р<0,05), равно как и сверхнормативное (в концентрации более 107 КОЕ/г) содержание лактобактерий – с 97,0±2,9% у детей 1-3 месяцев до 39,4±8,5% случаев в группе детей 6-12 месяцев. Следует отметить, что дефицитное состояние Escherichia coli с НФС в начальном возрастном периоде (1-3 месяца) регистрировали в 48,5±8,7% случаев, к 6 месяцам произошло снижение частоты регистрации признака до 12,0±5,3%, а к 1 году полностью нивелировалось.
При выделении бактерий K. oxytoca наблюдали обратную ситуацию: с увеличением возраста ребенка частота встречаемости дефицитных показателей бифидобактерий не уменьшалась и достигала 100% в первой и третьей группах, при этом в третьей группе (6-12 месяцев) отмечали дефицит E. coli c НФС (у 15,2±6,2% детей) и сверхнормативное количество лактобактерий (более 107 КОЕ/г) – у 97,0±2,9% обследованных.
У детей в возрасте от 1 до 6 месяцев (первая и вторая группы) совместно с K. pneumoniae вегетировали следующие микроорганизмы-симбионты: Enterococcus spp. – в рамках нормативных показателей (105-107 КОЕ/г), однако с гемолитической активностью (ГА) – по 9,1±4,9% в первой и 7,7±4,2% во второй группе; Е. coli с ГА (в 15,1±6,2% и 7,7±4,2% случаев, соответственно); Е. coli с слабой ферментативной активностью (СФА) с частотой встречаемости более 10% от общего количества кишечной палочки у 45,5±8,6% детей первой группы и 46,2±7,9% детей второй группы; S. aureus в 9,1±5,0% и 12,8±5,3% случаев и Clostridium spp. в концентрации более 103 КОЕ/г (15,2±6,2 и 12,8±5,3% случаев, соответственно). У детей третьей группы выделяли Е. coli с ГА (15,2±6,2% случаев), клостридии (более 103 КОЕ/г) и грибы рода Candida (по 9,1±5,0% случаев соответственно). С увеличением возраста у детей с ФН ЖКТ и вегетацией K. pneumoniae частота встречаемости микроорганизмов-ассоциантов в кишечной микробиоте уменьшалась, но появлялись ассоциации клебсиелл и грибов рода Candida (табл. 2).
Таблица 2
Микробы-ассоцианты, выделенные из кишечника детей первого года жизни с ФН ЖКТ при совместном вегетировании с Klebsiella spp., %
|
Вид микроорганизма |
При выделении штаммов K. pneumoniae (n=105) |
При выделении штаммов K. oxytoca (n=105) |
||||
|
1-3 мес. (n=33) |
3-6 мес. (n=39) |
6-12 мес. (n=33) |
1-3 мес. (n=35) |
3-6 мес. (n=37) |
6-12 мес. (n=33) |
|
|
Enterococcus spp. c ГА |
9,1±5,0 |
7,7±4,2 |
0 |
0 |
8,1±4,4 |
9,1±5,0 |
|
E. coli с ГА |
15,1±6,2 |
7,7±4,2 |
15,2±6,2 |
8,6±4,7 |
13,5±5,6 |
30,3±7,9 |
|
E. coli с СФА |
45,5±8,6* |
46,2±7,9* |
0 |
0 |
13,5±5,6 |
36,4±8,3* |
|
S. aureus |
9,1±5,0 |
12,8±5,3 |
0 |
14,3±5,9 |
21,6±6,7 |
15,2±6,2* |
|
Clostridium spp. |
15,2±6,2 |
12,8±5,3 |
9,1±5,0 |
8,6±4,7 |
21,6±6,7 |
30,3±7,9* |
|
Candida spp. |
0 |
0 |
9,1±5,0 |
0 |
0 |
30,3±7,9* |
|
Proteus spp. |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9,1±5,0 |
Примечание: * – показатели статистически значимы (р<0,05) при сравнении групп детей с выделенными видами бактерий – K. pneumoniae и K. oxytoca (t-критерий).
При вегетации K. oxytoca в первой группе детей были выделены E. coli c ГА, клостридии – по 8,6±4,7% случаев. В 14,3±5,9% случаев у детей в ассоциации с клебсиеллой был выделен золотистый стафилококк. У детей второй группы K. oxytoca сопутствовали Enterococcus spp. с ГА в 8,1±4,6% случаев, Е. coli с разным спектром свойств: с ГА и СФА (по 13,5±5,6% случаев, соответственно), S. aureus и Clostridium spp. (по 21,6±6,7% случаев). Группа детей 6-12 месяцев характеризовалась присутствием всего спектра выделяемых нами УПМ. Таким образом, при выделении бактерий K. oxytoca c увеличением возраста у детей с ФН ЖКТ статистически значимо увеличивался качественный и количественный состав кишечного микробиоценоза (при р<0,05), что свидетельствует о выраженной кишечной дисфункции у детей первого года жизни (ОСТ).
В настоящее время уже накоплены знания о том, что одной из причин увеличения масштабов медицинской значимости УПМ является рост их патогенного потенциала. Бактерии рода Klebsiella могут быть выделены из кишечника 8-10% здоровых взрослых. В тоже время в организме человека клебсиеллы, особенно К. oxytoca, считаются оппортунистическим патогеном, способным вызывать внутрибольничные инфекции у госпитализированных больных, в том числе детей и новорожденных. Доказано, что К. oxytoca может быть этиологическим агентом антибиотик-ассоциированного геморрагического колита (AAHC) у взрослых и подростков [7, 13]. Штаммы К. oxytoca способны производить цитотоксины, участвующие в патогенезе AAHC и обнаруживаются у 69% культур, выделенных от больных ААНС. При этом цитотоксины не были обнаружены у клебсиелл других видов, в том числе и у K. pneumoniae [14]. Кроме того, представители рода Klebsiella являются наиболее часто встречаемыми УПМ, изолируемыми от детей с дисбиотическими нарушениями [8]. Кишечный дисбактериоз, ассоциированный с К. oxytoca, также наблюдается среди детей с целиакией [15].
В нашем исследовании состояние микробиоты у детей с ФН характеризовалось значительным микроэкологическим дисбалансом (дисбиоз 3 степени), осложнённым пролиферацией бактерий рода Klebsiella. Эти нарушения не уменьшались с возрастом, а усугублялись присоединением микроорганизмов-ассоциантов, таких как грибы рода Candida (особенно при выделении бактерий K. oxytoca), что может говорить о начале воздействия таких повреждающих факторов как, например, антибактериальная терапия.
Анализируя возрастные периоды в течение первого года жизни ребёнка, следует отметить, что, по нашим данным, наиболее критическим у детей с ФН ЖКТ является возраст 3-6 месяцев. Можно предполагать, что дети раннего возраста инфицируются внутрибольничными штаммами клебсиелл в период пребывания в родильном доме, у детей же старшего возраста в связи с ведением прикорма и расширения границ жизнедеятельности происходит смена штаммового состава микрофлоры с заменой внутрибольничных видов на так называемые «дисбиозные» виды. По данным С.А.Егоровой и соавт. [6] генетические маркеры, ассоциируемые с патогенностью истинных возбудителей острых кишечных инфекций, достаточно редко обнаруживаются среди штаммов УПМ, выделенных от взрослых людей. Имеющиеся у семейства Enterobacteriaceae различные фимбриальные и нефимбриальные адгезины способствуют адгезии микроорганизмов к слизи и эпителию кишечного тракта, обеспечивая длительную персистенцию УПМ в кишечнике. Поэтому мы полагаем, что клебсиелл, особенно К. oxytoca, не следует рассматривать как часть нормальной микрофлоры кишечника. Учитывая клиническую картину, следует проводить селективную деконтаминацию этого микроорганизма у детей с дисбиотическими и функциональными нарушениями пищеварения.
Таким образом, у детей с ФН ЖКТ наблюдаются дисбиотические нарушения 3 степени, осложнённые пролиферацией бактерий рода Klebsiella, особенно таким диагностически значимым агентом, как K. oxytoca. Воздействие УПМ, их рост и персистенция образует «порочный круг» патологического процесса при развитии ФН ЖКТ у детей первого года жизни. Наиболее критическим для развития ФН ЖКТ у детей первого года жизни является возраст 3-6 месяцев. Длительная персистенция бактерий рода Klebsiella в высоком титре (105-108 КОЕ/г) в толстом кишечнике у детей с ФН ЖКТ диктует необходимость проведения селективной деконтаминации клебсиелл из микробиоценоза кишечника для воздействия на данных бактериальных агентов и, как следствие, разрушения «порочного круга» патологического процесса.
1. Anastasevich L.A. Intestinal colic in infants: causes, diagnosis, treatment. Russkiy meditsinskiy zhurnal 2008; 16(3):154-156 (in Russian).
2. Baiko S.V. Hemolytic uremic syndrome: epidemiology, classification, clinical features, diagnostic and treatment Review. Part 1. Nefrologiya i dializ 2007; 9(4):370-377 (in Russian).
3. Bondarenko V.M., Matsulevich T.V. Dysbacteriosis of the intestine as clinical and laboratory syndrome: current status of the problem. Moscow: GEOTAR-Media; 2007 (in Russian).
4. Buslenko A.O., Aleshukina A.V., Pshenichnaya N.Yu., Aleshukina I.S., Kostenko O.D. The cytokine profile in experimental klebsiellezny intestinal infections and the background of the therapy of various immunomodulatory drugs. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya 2015; 5:245 (in Russian). Available at: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=22357
5. Bukharova E.V., Popkova S.M., Rakova E.B., Dzhioev Yu.P., Shabanova N.M., Ivanova E.I., Nemchenko U.M., Savel'kaeva M.V. Microecological characteristics of Klebsiella spp. regional populations in the intestinal microbiota of Irkutsk children. Acta Biomedica Scientifica 2013; 2(2):93-96 (in Russian).
6. Egorova S.A., Makarova M.A., Kaftyreva L.A. Opportunictic enterobacteriacae as the cause of the acute diarrhea and gut disbiosis. Infektsiya i immunitet 2011; 1(2):181-184 (in Russian).
7. Malysh N.G., Golubnichaya V.N., Chemich N.D., Doan S.I. The biological characteristics of dominated agents of acute enteric infections. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika 2014; 59(10):45-48 (in Russian).
8. Nemchenko U.M., Popkova S.M., Gorbunova E.L., Petrova I.V., Rakova E.B., Ivanova E.I., Shabanova N.M., Savel'kaeva M.V. Microecological picture of intestinal biocenosis in children with functional disorders of gastrointestinal tract. Acta Biomedica Scientifica 2011; 5:89-93 (in Russian).
9. Nemchenko U.M., Savel'kaeva M.V., Rakova E.B., Ivanova E.I., Serdyuk L.V. Microecological characteristics of intestinal biocenosis of children with functional disorders of gastrointestinal tract. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika 2016; 61(6):368-371 (in Russian).
10. Serdjuk L.V., Popkova S.M., Rakova E.B., Nemchenko U.M., Savel'kaeva M.V., Leshhuk S.I., Kichigina E.L., Jurinova G.V. Algorithm of differential diagnosis and correction of intestinal dysbiosis. Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya 2014; 5-2:58-61 (in Russian).
11. Ursova N.I. Formation of intestinal microbiocenosis: the state of a problem. Voprosy sovremennoy pediatrii 2011; 10(4):62-69 (in Russian).
12. Uchaykin V.F., Shamsheva O.V. Infectious diseases in children. Moscow: GEOTAR-Media; 2015 (in Russian).
13. Darby A., Lertpiriyapong K., Sarkar U., Seneviratne U., Park D.S., Gamazon E.R., Batchelder C., Cheung C., Buckley E.M., Taylor N.S., Shen Z., Tannenbaum S.R., Wishnok J.S., Fox J.G. Cytotoxic and pathogenic properties of Klebsiella oxytoca isolated from laboratory animals. PLoS One 2014; 9(7):e100542.
14. Joainig M.M., Gorkiewicz G., Leitner E., Weberhofer P., Zollner-Schwetz I., Lippe I., Feierl G., Krause R., Hinterleitner T., Zechner E.L., Högenauer C. Cytotoxic effects of Klebsiella oxytoca strains isolated from patients with antibiotic-associated hemorrhagic colitis or other diseases caused by infections and from healthy subjects. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(3):817-824.
15. Sánchez E., Donat E., Ribes-Koninckx C., Fernández-Murga M.L., Sanz Y. Duodenal-mucosal bacteria associated with celiac disease in children. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79(18):5472-5479.
