Moskva, Moscow, Russian Federation
graduate student
Russian Federation
GRNTI 68.41 Ветеринария
The aim of the study is identification of features of Achilles tendon healing in the conditions of auto-transplantation of the cellular element, reflecting the regenerative activity of stromal-vascular fraction. Modern regenerative treat-ment methods for animal with tendon injuries involve stromal-vascular cells application of adipose tissue. They represent cell pool with high plasticity, proliferative activity, and ability to secrete multiple angiogenic factors. How-ever, there is no data on morphological and morphometric regenerative equivalents of their use in case of tendon ligaments injury. Micro morphometrical indicators are presented that substantiate the effectiveness of using autolo-gous cellular elements in case of Achilles tendon injury. The influence of stromal-vascular fraction from rat adipose tissue on regenerative process during healing of an induced tendon tissue defect was evaluated which lead to an increase in the thickness of bundles of the first and the second orders in the experimental group, significant differ-ences in comparison with the control of the fibroblastic cell pool, and the number of blood capillaries of these ani-mals. Based on the positive data of the autologous cell pool on the regenerative ability of the Achilles tendon, its practicability for veterinary medicine was scientifically justified. The experimental model of the study is a fancy rat (n=20). Achilles tendon was the research material. A complex methodological approach was used, including ex-perimental modeling, micro morphological studies, micro morphometry, and statistical data processing. It was re-vealed that experimental animals injected with stromal-vascular fraction, micro morphometric transformations of connective tissue were detected, aimed at thickening of bundles of the first and second orders, the transition of fi-broblasts to structured and ordered fibrocytes (tenocytes), acceleration of collagenogenesis and vascularization enhancement.
tendon, fibers, fraction, regeneration, vascularization, fibrocytes
Изучение восстановительных потенций тканей опорно-двигательного аппарата и путей направленного воздействия на ускорение репаративных процессов – одна из фундаментальных проблем ветеринарной травматологии и ортопедии [6, 7].
Стремительное развитие науки в области регенеративной медицины и клеточной биологии, фундаментальные исследования и поиск перспективных терапевтических подходов в данном направлении обещают в ближайшем будущем новые открытия. Высокий интерес к технологиям применения различных стволовых клеток во многом определен их потенциалом в восстановлении поврежденных тканей и органов [1, 3].
Суть применения таких технологий заключается в стимуляции восстановления поврежденных сухожилий с помощью клеток, взятых из организма самого объекта. Аутологичные клетки не отторгаются организмом животного после введения, поскольку распознаются его защитными системами как собственные [2, 3].
Современные регенеративные методы лечения животных с повреждениями сухожилий предполагают применение стромально-васкулярных клеток жировой ткани. Известно, что они представляют популяцию клеток, обладающих высокой степенью пластичности, пролиферативной активностью и способностью к секреции множества ангиогенных факторов [4, 5, 7]. Вместе с тем, отсутствуют данные о морфологических и морфометрических эквивалентах регенераторного процесса при их применении в условиях повреждения сухожильно-связочного аппарата.
Цель исследований – выявить особенности заживления ахиллова сухожилия в условиях аутотрансплантации клеточного продукта, отражающие регенераторную активность стромально-васкулярной фракции.
Задачи исследований – установить сравнительные микроморфометрические показатели пучков коллагеновых волокон ткани сухожилия 1 и 2 порядка в области травмы у животных экспериментальных групп (интактная, контрольная и подопытная); представить микроморфометрические показатели фибробластической популяции в сравниваемых группах; охарактеризовать степень васкуляризации ткани регенерата в зоне повреждения.
Материал и методы исследования. Исследования выполнены на базе кафедры «Анатомия и гистология животных им. профессора А. Ф. Климова» ФГБОУ ВО МГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина на трех группах декоративных крыс разновидности «Стандарт» (интактная, контрольная и подопытная), подобранных по принципу аналогов.
Экспериментальные группы были сформированы из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста, живой массы.
Использовали комплексный методический подход, включающий экспериментальное
моделирование с целью получения аутологичного клеточного продукта, анатомическое препарирование, гистологическое исследование биоптатов ахиллова сухожилия, микроморфологические исследования, микроморфометрию и статистическую обработку данных. В контрольной группе область повреждения заживала самопроизвольно, в подопытной группе – под влиянием аутологичных клеток стромально-васкулярной фракции. Ахиллово сухожилие животных интактной группы использовали для определения нормативных микроморфометрических показателей.
Все манипуляции с лабораторными животными проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г. ETS №123) после выдерживания их на двухнедельном карантине.
Изучение общей микроморфологической картины проводили при помощи светового микроскопа «Nikon» (Япония) после окраски гистологических срезов гематоксилином и эозином по Ван-Гизону по общепринятым методикам.
Микроморфометрию осуществляли с помощью программы «ImagScope». Оценку статистической значимости различий исследуемых показателей осуществляли с использованием критерия Стьюдента.
Результаты исследований. Как известно, ткань сухожилия относится к группе соединительных тканей, являясь плотной оформленной соединительной тканью. У крыс ее строение подчинено общим закономерностям, которые присущи животным других таксономических групп. Установлено, что функциональной единицей ткани является участок межклеточного вещества с сухожильными клетками, который окружен артериоло-венулярным анастомозом. Каждая функциональная единица характеризуется четкой цито-, фибро- и ангиоархитектоникой. Коллагеновые волокна окружены эндотеноном, вдоль которого располагаются цепочки клеток фибробластической популяции и сосуды капиллярного русла.
На основании данных сравнительного микроморфометрического анализа регенерата в исследуемых группах установлено, что на 7 сутки у особей контрольной группы пучки коллагеновых волокон первого порядка тонкие, не имеют строгой ориентационной упорядоченности и четких границ, в отличие от пучков первого порядка у крыс подопытной группы, которые по параметрам толщины коллагеновых конструкций опережали группу контроля. На 14 сутки наблюдений тенденция к увеличению толщины пучков сохранялась с преимуществом у подопытной группы. К 30 суткам эксперимента у крыс подопытной группы толщина пучков первого порядка существенно возрастала по сравнению с предыдущим сроком наблюдений. Следует отметить, что сами волокна приобретают волнистую конфигурацию, свойственную морфологической организации сухожилия в норме. На заключительном сроке эксперимента выявлены достоверные различия в показателях толщины пучков первого порядка у животных сравниваемых групп. Более того, морфометрические показатели сухожильной ткани у животных подопытной группы на 60 сутки практически соответствовали параметрам нормы (параметрам интактной группы) (табл. 1).
Таблица 1
Микроморфометрические показатели пучков первого порядка ахиллова сухожилия крыс
в контрольной, подопытной и интактной группах, мкм (Р≤0,05)
|
Сроки эксперимента |
Группа животных |
||
|
I группа (контроль) |
II группа (подопытная) |
III группа (интактная) |
|
|
7 сутки |
3,34±0,79 |
3,78±0,92 |
8,35±1,02 |
|
14 сутки |
3,55±0,79 |
4,86±0,45 |
|
|
30 сутки |
4,71±0,69 |
6,14±0,79 |
|
|
60 сутки |
4,76±0,50 |
6,42±0,67 |
|
При изучении микроморфометрических показателей на 14 сутки эксперимента было установлено, что на данном сроке регенеративного процесса в ткани сухожилия формируются хорошо различимые пучки второго порядка. Представители подопытной группы достоверно опережают по их толщине своих контрольных аналогов. Этот процесс усиливается к 30 суткам эксперимента. На заключительном сроке эксперимента (60 сутки) показатель толщины волокон в подопытной группе становится равен 40,1±6,8 мкм, что соответствует состоянию сухожильной ткани в норме (показатель толщины составляет 43,0±4,85 мкм) (табл. 2).
Таблица 2
Микроморфометрические показатели пучков второго порядка ахиллова сухожилия крыс
в контрольной, подопытной и интактной группах, мкм (Р≤0,05)
|
Сроки эксперимента |
Группа животных |
||
|
I группа (контроль) |
II группа (подопытная |
III группа (интактная) |
|
|
14 сутки |
17,6±2,37 |
23,2±3,41 |
43,0±4,85 |
|
30 сутки |
25,3±6,94 |
30,2±3,58 |
|
|
60 сутки |
33,4±7,11 |
40,1±6,8 |
|
При сравнительном анализе цитоархитектоники, и прежде всего клеток фибробластической популяции, выявлено, что на ранних сроках регенерации они многочисленны, так как способствуют формированию новой сухожильной ткани в зоне дефекта и тем самым активно задействованы в процессе коллагеногенеза. Вместе с тем, в подопытной группе обнаружено их достоверное, по сравнению с контролем, количественное уменьшение, в связи с приобретением фенотипа фиброцитов, что может отражать стадийность ремоделирования цитоархитектоники, которое начинается со стороны эндотенона (табл. 3).
Таблица 3
Количество фибробластов в зоне повреждения ахиллова сухожилия крыс
в контрольной, подопытной и интактной группах, шт.
|
Сроки эксперимента |
Группа животных |
||
|
I группа (контроль) |
II группа (подопытная) |
III группа (интактная) |
|
|
7 сутки |
121 |
102 |
36 |
|
14 сутки |
98 |
77 |
|
|
30 сутки |
74 |
61 |
|
|
60 сутки |
59 |
48 |
|
Одним из важных критериев полноценной регенерации сухожильной ткани является степень ее васкуляризации. При микроморфометрических исследованиях кровеносного русла ткани регенерата существенных различий между показателями их количества в сравниваемых группах не обнаружено. Вместе с тем, на 30 сутки наблюдений у животных в подопытной группе насыщенность ткани сухожилия капиллярами превосходит таковую в контроле. Из этого следует, что стромально-васкулярная фракция существенное влияние на развитие капиллярной сети в области дефекта оказывает на 30 сутки эксперимента (табл. 4).
Таблица 4
Количество кровеносных капилляров в зоне повреждения ахиллова сухожилия крыс
в контрольной, подопытной и интактной группах, шт.
|
Сроки эксперимента |
Группа животных |
||
|
I группа (контроль) |
II группа (подопытная) |
III группа (интактная) |
|
|
7 сутки |
3 |
5 |
6 |
|
14 сутки |
5 |
6 |
|
|
30 сутки |
4 |
8 |
|
|
60 сутки |
4 |
6 |
|
Заключение. Установлены особенности репаративной регенерации при индуцированном повреждении ахиллова сухожилия в условиях трансплантации аутологичного клеточного продукта – стромально-васкулярной фракции, выражающиеся в формировании в области повреждения органоспецифического регенерата и сокращений общих сроков заживления. Механизм ускоренной, в сравнении с контролем, регенерации травмированного сухожилия при аутотрансплантации тестируемого клеточного продукта связан со стимуляцией в области регенерата коллагено- и ангиогенеза, что коррелирует с установленными микроморфометрическими показателями. Установленные микроморфометрические показатели регенерата в области индуцированной травмы ахиллова сухожилия, направленные на стимуляцию и трофическое обеспечение регенераторного процесса, свидетельствуют о перспективности применения аутологичной стромально-васкулярной фракции в клинической практике при заживлении травм сухожилий у животных.
1. Bersenev, A. V. (2005). Kletochnaia transplantologiia - istoriia, sovremennoe sostoianie I perspektivi [Cell Transplantology - History, Current State and Prospects]. Kletochnaia transplantologiya I tkanevaia inzheneriia - Cell Transplantology and tissue engineering, 1, 32-33 [in Russian].
2. Veremeev, A. V. Bolgarin R. N., Petkova M. A., Katz N., & Nesterenko V. G. (2016). Ctromalino-vaskuliarnaia frakciya zhirovoi tkani kak aliternativnii istochnik kletochnogo materiala dlia regenerativnoi medicine [Stromal-vascular fraction of adipose tissue as an alternative source of cellular material for regenerative medicine]. Geny & kletki - Genes & Cells, XI, 1, 35-42 [in Russian].
3. Deev, R. V. (2014). Professor Aleksandr Aleksandrovich Maksimov: evoliuciia idei [Professor Alexander A. Maksimov: evolution of ideas]. Geny & kletki - Genes & Cells, IX, 2, 2-14 [in Russian].
4. Ivanov, A. V., & Kozlov, D. V. (2015). Sovremennie predstavleniia o mekhanizmah reparativnoi regeneracii ahillova suhozhiliia posle ego razriva [Modern ideas about the mechanisms of reparative regeneration of the Achil-les tendon after its rupture]. Vestnik Smolenskojgosudarstvennoj medicinskoj akademii - Bulletin of the Smolensk state medical Academy, 4, 74-79 [in Russian].
5. Yarygin, V. N. (2004). Tkaneviie kletochniie sistemi - osnova biomedicinskih kletochnih tekhnologii novogo pokoleniia: konturi Ideologii [Tissue cell systems-the basis of biomedical cell technologies of the new generation: contours of ideology]. Vestnik RAMN - Bulletin of the Russian Academy of Sciences, 9, 12-19 [in Russian].
6. Glazebrook, M. A., Wright, J. R., Langman, Jr. M., Stanish, D. W., & Lee, J. M. (2008). Histological Analysis of Achilles Tendons in an Over use. Rat Model. Journal of orthopaedic research, 840-846.
7. Smith, R. K. (2008). Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disabil Rehabil, 30, 1752-1758.
