Вирус африканской чумы свиней имеет свои генетические механизмы изменчивости. Большой интерес для научного сообщества представляет проблема эволюционной изменчивости генома вируса АЧС. А именно проблема эволюционной изменчивости генома вируса АЧС, изучение функций отдельных генов, их роли во взаимодействии с клеткой – хозяином и влияние на эволюционную изменчивость, как самого вируса, так и восприимчивого организма. Разнообразие генетических вариантов вируса является главным свойством этого возбудителя, а также отсутствие вакцины против данной болезни. Имея данные о генетической особенности вируса АЧС, а также изучении вариабельности известных генов позволяют расширить сведения о характере генетических изменений, а также получить молекулярно-эпизоотологическую картину циркуляции вируса АЧС как на территории Российской Федерации, так и в мире в целом. Анализ ряда маркерных генов позволят комплексно оценить генетические изменения вируса АЧС и их возможные фенотипические проявления. Изучение гена B602L позволяет более точно проводить дифференциацию европейских и азиатских изолятов внутри одного генотипа. Проведен филогенетический анализ по гену B602Lшестидесяти отечественных изолятоввируса АЧС выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг.В результате исследования, использованные, в работе изоляты удалось разбить на два кластера. Анализ полученных данных показал высокую консервативность изолятов и штаммов и позволил установить их генотипическую принадлежность. До сих пор остается не выясненным характер генетических и фенотипических изменений в геноме вируса АЧС.
African swine fever virus has its own genetic mechanisms of variability. Of great interest to the scientific community is the problem of the evolutionary variability of the ASF virus genome. Namely, the problem of the evolutionary variability of the ASF virus genome, the study of the functions of individual genes, their role in interaction with the host cell and the impact on the evolutionary variability of both the virus itself and the susceptible organism. The diversity of genetic variants of the virus is the main property of this pathogen, as well as the lack of a vaccine against this disease. Having data on the genetic features of the ASF virus, as well as the study of the variability of known genes, allow us to expand information about the nature of genetic changes, as well as to obtain a molecular epizootological picture of the circulation of the ASF virus both in the Russian Federation and in the world as a whole. Analysis of a number of marker genes will make it possible to comprehensively assess the genetic changes in the ASF virus and their possible phenotypic manifestations. The study of the B602L gene allows more accurate differentiation of European and Asian isolates within the same genotype. Phylogenetic analysis for the B602L gene of sixty domestic isolates of the ASF virus isolated in the Russian Federation from 2016 to 2017 was carried out. As a result of the study, the isolates used in the work were divided into two clusters. Analysis of the obtained data showed the high conservation of isolates and strains and made it possible to establish their genotypic affiliation. The nature of genetic and phenotypic changes in the genome of the ASF virus still remains unclear.
Введение. Африканская чума свиней (АЧС) – это контагиозная вирусная болезнь, поражающая домашних свиней и диких кабанов всех пород и возрастов. Это ДНК содержащий вирус, относящийся к семейству Asfiviridaeи роду Asfivirus [13, 16].Летальность у восприимчивых животных достигает 100% (высокая степень патогенности) [21]. Это заболевание оказывает разрушительные последствия для мировой свиноводческой отрасли, поскольку влечет за собой огромные экономические потери, складывающиеся из затрат на проведение карантинных и ветеринарно – санитарных мероприятий (убой всего поголовья) на территории очага болезни [1].Вирус АЧС является катастрофой для любой страны. Поскольку в настоящее время вирус АЧС продолжает распространяться и регистрироваться в новых европейских, азиатских странах являющихся ранее благополучными. Циркуляция вируса АЧС среди домашних свиней, а также попадание вируса в дикую природу к кабанам усложняет ликвидацию заболевания [6, 12].На сегодняшний день до сих пор не разработана безопасная и эффективная коммерческая вакцина против АЧС [7, 10, 20]. Вирус АЧС обладает большой эволюционной скоростью изменчивости (3,31 × 10−4 замен/позиция/год с экспоненциальным ростом 0,01 в год-1) по сравнению с другими крупными ДНК содержащими вирусами АЧС [3]. Изоляты вируса АЧС различаются по своим биологическим свойствам, поэтомувопрос их группирования и классификации, а также генотипирования и сероиммунотиповой идентификации является главенствующим [2, 4, 5].Генетическую вариабельность вируса АЧС изучают методом секвенирования определенных фрагментов геномов или проведение полногеномного и сравнения их с известными изолятами и штаммами.Цель исследования – провести филогенетический анализ отечественных изолятов вируса африканской чумы свиней по гену B602L. Условия, материалы и методы. Исследования проводились на базе ФГБНУ «Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии». Объектами исследования являлись 60 отечественных изолятов вируса АЧС выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг. Во всех исследованных образцах было показано наличие генома вируса АЧС при исследовании методом ПЦР в режиме реального времени. Выделение ДНК осуществляли набором «Рибо-сорб» (Интерлабсервис, Россия), согласно инструкции производителя.Реакцию ПЦР проводили в амплификаторе «MaxyGeneGradient», (США). Температурный режим и количество циклов для прибора «СFX96Touch» составлял: 3 мин денатурации при температуре 94°C; отжиг праймеров при 53°C –30 сек, элонгация при 72°C – 45 сек. (40 циклов).Анализ ДНК осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, содержащем 0,001% интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили при силе тока 50 мА и напряжении 150 В в течение 40 минут. ДНК визуализировали на гель-документирующей системе «ChemiDoc MP» («Bio-RadLaboratories», США) в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.Очистка полученных из геля ПЦР-продуктов осуществлялась с применением набора “Cleanup - standard” (Евроген, Россия). Набором Bigdyeterminator v3.1 (Applied Biosystems, США) проводилась сиквенсовая реакция в соответствии с инструкцией производителя. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена B602L, вируса АЧС проводили с использованием специфических для определѐнного фрагмента генома праймеров: ORF9L-F1 (5'AATGCGCTCAGGATCTGTTAAATCGG3'); ORF9L-R2 (5'TCTTCATGCTCAAAGTGCGTATACCT3') [9].Далее полученные нуклеотидные последовательности фрагментов гена вируса АЧС собирали и выравнивали с использованием компьютерной программы «BioEdit v.7» [15]. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями гена вируса АЧС взятых из базы данных «GenBank» с использованием программы «BLASTN» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[8].Для построения дендрограммы применяли метод «Bootstrap» (максимального правдоподобия) с анализом 1000 случайных выборок, с использованием программы «Mega 7.0» [17].Результаты и обсуждения. Наиболее известным и информативным маркером для изучения генетического разнообразия между отечественными изолятами и штаммами вируса АЧС считается ген B602L. Он часто используется в молекулярно-генетических исследованиях. Этот маркерный генпозволяет более точно выявлять филогенетические взаимоотношения между штаммамивируса АЧС.Ген B602L (CVR) располагается в центральной вариабельной области генома. Является наиболее вариабельным участком генома и содержит повторы длиной 12 п.н. В гене B602L локализовано большое количество повторяющихся аминокислотных тетрамеров они варьируются по количеству и составу у различных штаммов и изолятов вируса АЧС [14, 22].В настоящее время известно, что все исследованные отечественные изоляты выделенные на территории Российской Федерации имеют только один из вариантов центральной вариабельной области гена B602L(CVR1) [19].Следует отметить, что у эстонских изолятов второго генотипа выделенных в популяции дикого кабана, были обнаружены два генетических варианта (CVR-1 и CVR-2), содержащих семь и десять тетрамеров [18].До сих пор неизвестны причины вариабельности гена B602L однако имеются данные о том, что белок pB602L кодируемый таким же геном принимает участие в корректировке правильности формирования вторичных и третичных структур капсидного белка p72 и является неструктурным белком, который исключен из процесса репликации вируса АЧС [22].Этот ген, как и многие другие, позволяет выявить изменения среди изолятов вируса АЧС. Поэтому для определения филогенетического родства отечественных изолятов выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг. нами была определена нуклеотидная последовательность этого гена.С целью определения филогенетических отношений изолятов и штаммов вируса, отечественных изолятов вируса АЧС выделенных в 2016 по 2017 гг. и данных взятых из «GenBank» был проведен филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей гена B602L с использованием статистического метода «максимального правдоподобия». (рис. 1). Анализ изолятов вируса АЧС проводился программой «MEGA v.5.2». Построенная дендрограмма отражает филогенетические отношения штаммов и изолятов из стран Европы и Азии, представляющие II генотип вируса (табл. 1). Таблица 1 – Изоляты вируса АЧС из стран Европы и Азии, взятые из генбанка и использованные при построении филогенетического древа по гену B602LКод штамма вирусаСтранаВыделен отГодГенотипКод последовательности в ГенбанкGeorgia 2007/1ГрузияДикий кабан2007IIFR682468.2Belgium/Estalle /wb/2018БельгияСвиньи2019IIMK543947Belgium 2018/1БельгияСвиньи2019IILR536725Estonia 2014ЭстонияСвиньи2014IILS478113Wuhan 2019-2КитайСвиньи2019IIMN393477China/2018/AnhuiXGOКитайСвиньи2018IIMK128995Pig/HlJ/2018КитайСвиньи2018IIMK333180 Также для сравнения изолятов нами был выбран референс – штамм референс-штаммом «Georgia 2007/1» (FR682468.2), который впервые был обнаружен в 2007 году. Согласно филогенетическому анализу по гену B602L все исследованные изоляты и штаммы вируса АЧС по степени гомологии разделились на два кластера. Так, сорок восемь изолятов отечественного происхождения были сгруппированы в один кластер с изолятами и штаммами из стран Европы и Азии. Анализ нуклеотидных последовательностей этих изолятов показал высокую консервативность (100 % гомология). Рисунок 1 – Филогенетическое древо, построенное по методу «Bootstrap (максимального правдоподобия)» на основании данных нуклеотидных последовательностей B602Lизолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ с 2016 г. по 2019 г. Во втором кластере представлены двенадцать отечественных изолятов, их группообразование произошло благодаря имеющимся идентичным единичным заменам в нуклеотидной последовательности. Выводы. Таким образом, согласно проведенному филогенетическому анализу по гену B602L удалось установить, что выделенные на территории Российской Федерации отечественные изоляты с 2016 по 2017 года оказались идентичными (100% гомология) и принадлежат ко второму генотипу.В дальнейшем обнаружение большого количества новых изолятов с генетическими мутациями в нуклеотидных последовательностях по гену B602L позволит провести их дифференциацию. Работа выполнена при поддержки гранта Президента РФ МК-2000.2017.11 от 22.02.17.