Благовещенск, Амурская область, Россия
Благовещенск, Амурская область, Россия
Благовещенск, Амурская область, Россия
Цель исследования – установить зависимость угрозы ранних выкидышей от уровня плацентарного фактора роста (PlGF) в крови беременных с различной активностью цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции. Было проведено проспективное исследование по типу случай-контроль 100 женщин на сроке 9-11 недель беременности, из которых 83 ЦМВ-серопозитивных и 17 ЦМВ-серонегативных. Дальнейшее распределение по подгруппам проводилось с учетом маркеров репликационной активности ЦМВ и характера осложнений беременности. В 15,7% случаев в крови ЦМВ-серопозитивных женщин, чья беременность закончилась самопроизвольным абортом на сроке 10-11 недель, выявлены маркеры высокоактивной ЦМВ инфекции и значительное снижение показателей PlGF в крови (р<0,001). В 53% случаев беременность осложнялась угрозой прерывания, но с последующей пролонгацией. В данной подгруппе при менее выраженной активности ЦМВ показатели PlGF были более высокими (р<0,001). В 31,3% случаев диагностировано латентное течение заболевания, при котором уровень энзима значимо не отличался от таковых значений контрольной группы, что соотносилось с минимальным риском развития угрозы прерывания. При морфологическом исследовании ворсинчатого хориона от ЦМВ-серопозитивных женщин с самопроизвольным абортом выявлены цитомегалические клетки в трофобласте, множественные аваскулярные и некротизированные ворсины. Полученные данные свидетельствуют о ЦМВ-зависимом ингибировании секреции клетками трофобласта PlGF, которое определяется уровнем вирусной активности и приводит к нарушению морфоструктуры плаценты и обусловленную этим редукцию плацентарного кровотока, задержку развития эмбриона и при высокой вирусной нагрузке – его гибель.
цитомегаловирусная инфекция, угроза прерывания беременности, плацентарный фактор роста.
Высокий процент гестационных потерь (20-25%) и широкое распространение герпесвирусной инфекции, в том числе цитомегаловируса (ЦМВ), среди женщин репродуктивного возраста (75-90%), указывают на медико-социальную значимость данной проблемы [2, 4, 5]. Важно и то, что ЦМВ обладает высокой тератогенностью – второе место после вируса краснухи, что способствует нарушению морфогенеза плаценты и эмбриональных структур, пролонгирующих прерывание и невынашивание беременности ранних сроков [1, 5]. Другими факторами, лежащими в основе патологических нарушений плацентации, гестации на различных сроках беременности, являются цитокины и сосудистые факторы роста [6]. Среди факторов, регулирующих ангиогенез гестационного периода, выделяют плацентарный фактор роста (PlGF) [8, 9, 12, 14]. Его секреция гигантскими клетками трофобласта, как показывают исследования, является сигналом, инициирующим и координирующим васкуляризацию в децидуальной оболочке и плаценте во время раннего эмбриогенеза [7, 10]. Неадекватное формирование и дисфункция сосудов плаценты приводят к развитию недостаточности первой волны инвазии трофобласта и обусловленной этим редукции маточно-плацентарного кровообращения, гипоплазии плаценты и задержке внутриутробного развития эмбриона [3]. Эти данные согласуются с результатами исследования A.Khaliq et al. [11], которые считают, что локализация в большом количестве мРНК и протеина PlGF в синцитиокапиллярной мембране ворсин плаценты указывает на то, что PlGF может выступать как паракринный медиатор формирования кровеносных сосудов плаценты в процессе ангиогенеза.
Вместе с тем, в литературе отсутствуют данные, доказывающие вовлеченность PlGF в патогенез ранних самопроизвольных выкидышей при различной активности ЦМВ инфекции.
Цель исследования – установить зависимость угрозы ранних самопроизвольных выкидышей от уровня PlGF в крови беременных с различной активностью ЦМВ инфекции.
Материалы и методы исследования
Проведено проспективное исследование по типу случай-контроль 100 женщин на первом триместре беременности (9-11 недель), из них 83 – ЦМВ-серопозитивные (основная группа) и 17 – ЦМВ-серонегативные (контрольная группа). Все беременные из основной группы на первом этапе исследования были разделены на две подгруппы, соответственно, с обострением ЦМВ инфекции – подгруппа 1 (57 случаев) и латентным течением заболевания – подгруппа 2 (26 случаев).
На втором этапе в зависимости от исхода беременности женщины основной группы были разделены на подгруппы – с начавшимся самопроизвольным выкидышем с прерыванием беременности на сроке до 12 недель (подгруппа 1а, 13 случаев) и с пролонгированной беременностью (подгруппа 1б, 70 случаев).
Критериями включения в исследование явились: хроническая ЦМВ-инфекция (обострение в первом триместре беременности или ее латентное течение), стойкая клиническая ремиссия герпесвирусной инфекции.
Критерии исключения из исследования: первичная ЦМВ-инфекция, обострение других воспалительных экстрагенитальных заболеваний, наличие передающихся половым путем инфекций, возраст старше 27 лет, аномалии развития половых органов, один и более самопроизвольных выкидышей при сроке беременности 10 недель и более.
Клинический диагноз первичной ЦМВ устанавливался по наличию в периферической крови антител класса IgM к ЦМВ, низкоавидных IgG (индекс авидности менее 65%), а также ДНК ЦМВ, выявленной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в крови; обострение хронической ЦМВ инфекции – по наличию IgM к ЦМВ, высокоавидных IgG (индекс авидности более 65%), а также ДНК ЦМВ в соскобах буккального эпителия и слизистой оболочки шейки матки.
Обследование проводили с учетом Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 2008) и Правил клинической практики в Российской Федерации, утвержденных приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266. Все женщины подписали письменное информационное согласие.
У обследуемых взятие крови для ПЦР проводили в стандартные вакуумные пробирки с коагулянтом в количестве 5 мл. Для серологических исследований использовали кровь, не содержащую коагулянты. Выделение мононуклеарных клеток крови для ПЦР проводилось с использованием раствора фиколл-урографина плотностью 1,077 г/мл (НПО ДНК-технология, Россия). Серологические исследования выполняли в парных сыворотках с интервалом 10-14 сут. Утренняя порция мочи для ПЦР-анализа собиралась в стерильный контейнер объемом 60 мл. Забор буккального эпителия и содержимого цервикального канала производили стерильным тупфером в стандартные пластиковые пробирки с физиологическим раствором объемом 0,5 мл. Ворсинчатый хорион для ПЦР-анализа забирали сразу после медицинского вмешательства по случаю начавшегося самопроизвольного аборта.
Определение типоспецифических антител IgМ и IgG (качественный и количественный анализ), авидности антител класса IgG в крови осуществлялось методами иммуноферментного анализа на микропланшетном ридере Stat Fах-2100 с использованием тест-систем ЗАО Вектор-Бест (Россия), PlGF – наборами Quantikine PlGF Human (США). Выявление ДНК ЦМВ в биологическом материале (кровь, моча, содержимое цервикального канала, соскоб с буккального эпителия, ворсинчатый хорион) проводили методом ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Россия).
Для морфологических исследований плацентарный материал фиксировали на холоде в 2,5% глютаральдегиде на 0,1 М кокадилатном буфере при рН 7,4 в течение часа. Далее его отмывали в соответствующем буфере с добавлением сахарозы. Последующую фиксацию проводили в 2% растворе четырехокиси осмия в течение 20-30 минут. После дегидратации в серии спиртов и ацетона образцы заливали в смесь смол аралдит и эпон-812. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм готовили на ультрамикротоме LKB-8800 (Швеция) и окрашивали толуидиновым синим. Гистохимические методы – окраску по Ван Гизону – проводили на парафиновых срезах после фиксации 4% раствором параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4).
Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для определения достоверности различий использовали непарный параметрический критерий Стьюдента. Критический уровень значимости был принят за 5% (0,05). Данные представлены как среднее арифметическое и стандартная ошибка среднего арифметического (М±m).
Результаты исследования
В результате проведенного сероиммунологического обследования 100 женщин на сроке беременности 9-11 недель, положительные маркеры ЦМВ инфекции выявлены у 83 (83%) женщин. Среди них у 57 (68,7%) обследованных в основной группе – подгруппа 1а и 1б – выявлены одновременно типоспецифические антитела к ЦМВ IgM и IgG, что указывало на активную форму инфекции. У 26 (31,3%) – подгруппа 2 – выявлены только антитела IgG, свидетельствующие о латентном течении заболевания.
В подгруппе 1а у 13 обследуемых (15,7%) уровень антител IgM к ЦМВ был максимальным и составил 2,0±0,7 ЕД/мл (ОПкр=0,210 ЕД/мл), что выше, чем в подгруппе 1б (р<0,001). Титр антител IgG был на уровне 1:1600, что выше, чем в подгруппе 1б (р<0,001) и подгруппе 2 (р<0,001). Средние значения индекса авидности составили 88±1,0%, что ниже, чем в подгруппах 1б и 2 (p<0,05), но выше граничных значений. Во всех случаях ДНК ЦМВ был выявлен в содержимом цервикального канала. Полученные результаты свидетельствовали о наличии высокоактивной формы ЦМВ инфекции.
В подгруппе 1б у 44 обследуемых (53%) уровень антител IgM к ЦМВ был в пределах 0,7±0,2 ЕД/мл (ОПкр=0,210 ЕД/мл), что значительно ниже, чем в подгруппе 1а (р<0,001). Значения титра антител IgG к ЦМВ также были ниже в предыдущей подгруппе и составили 1:800. Индекс авидности антител IgG не превышал значений 96±1,0% (р<0,001). ДНК ЦМВ в 13,6% случаев выявлялся в содержимом цервикального канала и в 86,4% случаев – в соскобе с буккального эпителия, что также указывало на обострение инфекционного процесса, но с менее выраженным уровнем вирусной активности.
У всех обследованных подгруппы 2 выявлены типоспецифические антитела IgG к ЦМВ с титром 1:400, что значимо ниже, чем в подгруппах 1а и 1б (р<0,001). Значения индекса авидности достоверно не отличались от показателей в подгруппе 1б и составили 97±1,3% (р>0,05). ДНК ЦМВ в биологическом материале выявлен не был.
При анализе содержания PlGF в обследуемых подгруппах максимально низкие значения были в подгруппе 1а, которые составили 53,7±1,61 пг/мл (контрольная группа – 69,0±1,28 пг/мл; р<0,001). В подгруппе 1б показатели протеина были на уровне 61,2±1,53 пг/мл (р<0,01) и в подгруппе 2 – 67,0±1,37 пг/мл (р>0,05), что указывало на ЦМВ-зависимое влияние выработки сосудистого фактора роста клетками трофобласта.
При исследовании образцов ворсинчатого хориона от ранних самопроизвольных выкидышей (подгруппа 1а) 27±3,77% были инфицированы ЦМВ. Их морфологическое исследование показало наличие как специфических, так и неспецифических маркеров, отражающих степень повреждаемости клеточных структур ворсинчатого хориона ЦМВ. В первую очередь обращало внимание наличие цитомегалического метаморфоза клеток цитотрофобласта при недоразвитии синцитиотрофобласта во вторичных ворсинах (рис. А).
Это приводило к тому, что до 37±1,3% терминальных ворсин находилось в состоянии гибели (рис. Б), что значительно уменьшало микроциркуляцию в маточно-плацентарной зоне. Строма таких ворсин была некротизирована (рис. В). Часто встречались аваскулярные ворсины, либо отмечалось нарушение дифференцировки мезенхимальных клеток в сторону образования эндотелия сосудов, что также указывало на редукцию плацентарного кровообращения (рис. Г).
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
||||
|
|
Рис. Ворсинчатый хорион на сроке 10-11 недель беременности, медицинский аборт. Высокоактивная ЦМВ инфекция. А – Цитомегалический метаморфоз клеток цитотрофобласта. Полутонкий срез. Окраска толуидиновым синим. Увеличение: 40×100. Б – Гибель большинства ворсинок. Окраска по Ван Гизону. Увеличение: 40×90. В – Некроз стромы ворсинки. Окраска по Ван Гизону. Увеличение: 10×100. Г – Мезенхимальные клетки округляются, увеличиваются в размерах и не дифференцируются в сторону образования сосуда. Окраска по Ван Гизону. Увеличение: 40×100. |
|||||
Обсуждение результатов исследования
Особое место в этиологии ранних самопроизвольных выкидышей принадлежит ЦМВ инфекции [1, 4]. Даже бессимптомная ЦМВ инфекция в период ее высокой активности у беременной может привести к выраженным нарушениям формирования плаценты и ее кровеносного русла, вплоть до гибели эмбриона. Этот феномен в значительной степени обусловлен тропизмом ЦМВ к определенным тканям: плацентарным и эмбриональным. Этим можно объяснить наличие нарушений морфогенеза плаценты и эмбриопатий, вызванных ЦМВ инфекцией на ранних сроках беременности.
Следовательно, активация ЦМВ инфекции способствует развитию невынашивания ранних сроков, что согласуется с полученными данными. В 83% случаев были обнаружены типоспецифические антитела к ЦМВ в крови женщин на первом триместре беременности, из которых 68,7% соотнесены с обострением заболевания и 31,3% – с латентным ее течением. Среди ЦМВ-серопозитивных женщин высокоактивная форма ЦМВ инфекции встречалась в 15,7% случаев. У этих же женщин отмечалась высокая частота выявления клинических и ультразвуковых признаков угрозы прерывания беременности [7], которая, несмотря на проводимую терапию, завершилась самопроизвольным ее прерыванием на сроке 10-11 недель. В 53% случаев угроза прерывания беременности соотносилась со средней активностью ЦМВ инфекции, что способствовало на фоне проводимой терапии ее пролонгации. При латентном течении заболевания частота развития осложнений беременности не отличалась от таковой в группе ЦМВ-серонегативных женщин.
Одним из возможных патогенетических механизмов развития невынашивания ранних сроков можно считать ЦМВ-зависимое ингибирование секреции гигантскими клетками трофобласта протеина PlGF. Полученные данные согласуются с результатами исследований A.Khaliq et al. [11] и V.Shore et al. [13], в которых показано, что PlGF, с одной стороны, инициирует ангиогенез и повышает проницаемость сосудов внутри плацентарного ложа, с другой – посредством аутокринного механизма действия регулирует инвазию, дифференцировку и метаболическую активность трофобласта в момент плацентации. В то же время структурная готовность маточно-плацентарного кровотока определяется степенью инвазии клеток вневорсинчатого трофобласта в стенки спиральных артерий плацентарного ложа, т.е. в зону анатомического контакта межворсинчатого пространства плаценты и подлежащего эндометрия матки. К 8-10 неделе гестации наступает первая волна инвазии вневорсинчатого трофобласта в плацентарное ложе [3], которая в течение 8-12 недели распространяется на эндометриальные сегменты спиральных артерий и обусловливает формирование постоянного маточно-плацентарного кровотока, адекватного потребностям эмбриона.
Однако при ЦМВ инфицировании формируются условия для недостаточной секреции PlGF, обусловливающей нарушения формирования плаценты и ее тканевых структур. Подавление пролиферативных процессов и дедифференцировка мезенхимальных клеток приводит к появлению аваскулярных ворсин, что отражается на характере маточно-плацентарного кровообращения.
Таким образом, имеются все основания полагать, что установленное нарушение секреции PlGF трофобластом, которое соотносится с активностью ЦМВ инфекции на ранних сроках беременности, представляет собой весомый патогенетический механизм развития раннего невынашивания, обусловленного недостаточностью инвазии и миграции трофобласта с последующей редукцией маточно-плацентарного кровообращения, гипоплазией плаценты и задержкой развития, либо гибелью эмбриона.
1. Кулаков В.И., Гуртовой Б.Л., Орджоникидзе Н.В., Тютюнник В.Л. Цитомегаловирусная инфекция в акушерстве. М: ГЭОЭТАР-Мед, 2001. 32 с.
2. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Довжикова И.В. Морфофункциональная характеристика фетоплацентарного комплекса у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции, и патоморфологические изменения в органах плода // Архив патологии. 2010. Т.72, №4. С.47-49..
3. Милованов А.П., Фокин Е.И., Рогова Е.В. Основные патогенетические механизмы хронической плацентарной недостаточности // Архив патологии. 1995. Т.57, № 4. С.11-16.
4. Радзинский В.Е., Запертова Е.Ю., Мисник В.В. Генетические и иммунологические аспекты привычного невынашивания беременности // Акушерство и гинекология. 2005. №6. С.24-29.
5. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. М.: Триада-Х, 2005. 304 с.
6. Соколов Д.И. Васкулогенез и ангиогенез в развитии плаценты // Журнал акушерства и женских болезней. 2007. Т.LVI, №3. С.129-133.
7. Andrievskaya I.A., Lucenko M.T., Babenko O.P. Specific and non-specific factors of humoral immunity as markers for pregnancy loss in women with cytomegalovirus infection // International Journal of Biomedicine. 2015. Vol.5. №4. P.184-187. doi:https://doi.org/10.21103/Article5(4)_OA2
8. DiSalvo J., Bayne M.L., Conn G., Kwok P.W., Trivedi P.G., Soderman D.D., Palisi T.M., Sullivan K.A., Thomas K.A. Purification and characterization of a naturally occurring vascular endothelial growth factor-placenta growth factor heterodimer // J. Biol. Chem. 1995. Vol.270, №13. P.7717-7723.
9. Forbes K., Westwood M. Maternal growth factor regulation of placental development and fetal growth // J. Endocrinol. 2010. Vol.207, №1. P.1-16.
10. Kurz H., Wilting J., Sandau K., Christ B. Automated evaluation of angiogenic effects mediated by VEGF and PLGF homo-and heterodimers // Microvasc. Res. 1998. Vol.55, №1. P.92-102.
11. Khaliq A., Li X.F., Shams M., Sisi P., Acevedo C.A., Whittle M.J., Weich H., Ahmed A. Localization of placenta growth factor (PLGF) in human term placenta // Growth Factors. 1996. Vol.13, №3-4. P.243-250.
12. Plaisier M., Dennert I., Rost E., Koolwijk P., van Hinsbergh V.W., Helmerhorst F.M. Decidual vascularization and the expression of angiogenic growth factors and proteases in first trimester spontaneous abortions // Hum. Reprod. 2009. Vol.24, №1. P.185-197.
13. Shore V.N., Wang T.N., Wang T.L., Torry R.G., Caudle M.R., Torry D.S. Vascular endothelial growth factor, placenta growth factor and their receptors in isolated human trophoblast // Placenta. 1997. Vol.18, №8. P.657-669.
14. Tjoa M.L., van Vugt J.M., Mulders M.A., Schutgens R.B., Oudejans C.B., van Wijk I.J. Plasma placenta growth factor levels in midtrimester pregnancies // Obstet. Gynecol. 2001. Vol.98, №4. Р.600-607.
