Как известно, первый год жизни ребенка является важным и серьезным этапом в становлении стабильного кишечного микробиоценоза. Процесс становления нормальной бактериальной флоры кишечного биотопа начинается сразу же после рождения ребенка. Основными факторами, обеспечивающими этот процесс у детей, являются: первичная колонизация, толерантность, основные системы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), грудное молоко, пробиотики [11]. Факторами, оказывающими негативное воздействие на формирование микробного фона в толстом кишечнике являются: искусственное вскармливание, лекарственные средства, внутрибольничная среда и др. [1–3, 12]. У грудных детей нормальная бактериальная флора кишечника находится в динамическом равновесии и не вызывает заболеваний. Известно, что в поддержании гомеостаза микробиоценоза толстого кишечника большое значение имеет состояние слизистой оболочки ЖКТ, которая, как и кожа, являясь барьером, отражает негативное воздействие условно-патогенных микроорганизмов (УПМ). Таким образом, при фиксации на эпителии слизистой оболочки толстого кишечника представители нормальной бактериальной флоры образуют пристеночный слой, обеспечивающий колонизационную резистентность организма [9]. Однако, равновесие флоры может нарушаться, и УПМ могут стать причиной патологических процессов, при которых микробиоценоз кишечника будет характеризоваться неустойчивостью, связанной с микробной сукцессией УПМ, приводящей к неадекватному иммунному ответу организма и развитию функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта (ФН ЖКТ) [5]. Нередко цепь таких явлений в кишечнике при ФН ЖКТ замыкается в «порочный круг», в результате которого организм не может без помощи извне выйти из этого состояния [10]. Одним из бактериальных агентов кишечного биоценоза, ломающим защитные механизмы организма, могут быть бактерии рода Klebsiella, обладающие комплексом факторов патогенности, присущих семейству Enterobacteriaceae, и способных за счет этого не только к длительному нахождению в ЖКТ, но и к транслокации в несвойственные биотопы организма хозяина [4]. Klebsiella spp. высеваются из кишечника у детей первого года жизни с ФН ЖКТ с высокой частотой (до 60% случаев), приводя к появлению выраженных микроэкологических нарушений микробиоты кишечника [5].Цель исследования – установить особенности микробиоценоза толстого кишечника на фоне высокой популяционной плотности бактерий рода Klebsiella у детей с ФН ЖКТ в разных возрастных периодах первого года жизни. Материалы и методы исследования Материалом для исследования служили фекалии 210 детей первого года жизни с ФН ЖКТ обоих полов при индикации в них бактерий рода Klebsiella в титре 105-108 КОЕ/г. Бактериальная флора микробиоценоза толстого кишечника, выделенная как у мальчиков, так и у девочек достоверно не отличалась (р>0,05), что позволило их объединить в одну группу (n=210). Дети были распределены по возрасту на следующие группы: первую группу составили дети от 1 до 3 месяцев, вторую группу – дети от 3 до 6 месяцев, в третью группу – дети от 6 до 12 месяцев жизни. Также все обследуемые были разбиты на 2 группы сравнения, в зависимости от вида выделяемых клебсиелл – K. pneumoniae (n=105) и K. oxytoca (n=105). Учитывая, что у здоровых детей Klebsiella spp. в норме может присутствовать в концентрации менее 104 КОЕ/г, сравнение исследуемых групп детей у которых Klebsiella spp. детектируется в концентрации более 105 КОЕ/г с группой здоровых детей было нецелесообразным.В соответствии с ОСТ (Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». ОСТ 91500.11.0004-2003. Приказ МЗ РФ № 231 от 09.06.2003) у всех детей (n=210) клинически отмечали следующие симптомы: запоры в 14,3% случаев, «неустойчивый» стул в 75,2% случаев. Периодические колики выявлены в 74,8% случаев. Метеоризм часто сопровождал колики и наблюдался у 78,6% детей. Срыгивания после кормления в объеме более 1 чайной ложки (5 мл), повторяющиеся до 5-8 раз в день, встречались у трети наблюдаемых младенцев – в 31,9% случаев.Исследование проводилось на базе клиники Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека (г. Иркутск). В работе с исследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциацией (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, в редакции, Бразилия, октябрь 2013) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266. Исследования микрофлоры толстого кишечника проводили по стандартной методике, оценка результатов – в соответствии с ОСТ. Выделенные микроорганизмы идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с использованием API-систем «bioMérieux» (Франция).Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Excel из пакета MS Office 2007, Statistica 6.1. Результаты исследования и их обсуждение Микроэкологический пейзаж кишечника у всех детей с ФН ЖКТ характеризовался нарушениями количественного и качественного состава микроорганизмов толстой кишки, в том числе были обнаружены изменения в составе индигенной микробиоты в зависимости от возрастного периода и видовой принадлежности выделенных штаммов клебсиелл. Оценка резидентной микрофлоры производилась по трем основным интегративным показателям: дефицит бифидобактерий, компенсаторное увеличение титра лактобактерий, диссоциация эшерихий по способности ферментировать лактозу (табл. 1).Таблица 1Характеристика основных представителей индигенной микробиоты толстого кишечника у детей первого года жизни при выделении бактерий рода Klebsiella, % ПараметрДефицит бифидобактерийСверхнормативное к-во лактобациллДефицит E.coliс НФС1-3 мес.3-6 мес.6-12 мес.1-3 мес.3-6 мес.6-12 мес.1-3 мес.3-6 мес.6-12 мес.При выделении K. pneumoniae (n=105)93,995,030,397,010039,448,512,80При выделении K. oxytoca (n=105)10045,910010097,397,00015,2 С увеличением возраста у детей с ФН ЖКТ при выделении штаммов K. pneumoniae отмечали изменение количественных показателей по всем трём позициям – содержание бифидобактерий, лактобацилл и Escherichia coli с нормальными ферментативными свойствами (НФС) – относительно физиологических нормативов по ОСТу.При выделении штаммов K. pneumoniae бифидобактерии в концентрации менее 1010 КОЕ/г (дефицит) уменьшалось с 93,9±4,2% у детей первых трех месяцев до 30,3±7,9% случаев к 6-12 месяцам (р<0,05), равно как и сверхнормативное (в концентрации более 107 КОЕ/г) содержание лактобактерий – с 97,0±2,9% у детей 1-3 месяцев до 39,4±8,5% случаев в группе детей 6-12 месяцев. Следует отметить, что дефицитное состояние Escherichia coli с НФС в начальном возрастном периоде (1-3 месяца) регистрировали в 48,5±8,7% случаев, к 6 месяцам произошло снижение частоты регистрации признака до 12,0±5,3%, а к 1 году полностью нивелировалось.При выделении бактерий K. oxytoca наблюдали обратную ситуацию: с увеличением возраста ребенка частота встречаемости дефицитных показателей бифидобактерий не уменьшалась и достигала 100% в первой и третьей группах, при этом в третьей группе (6-12 месяцев) отмечали дефицит E. coli c НФС (у 15,2±6,2% детей) и сверхнормативное количество лактобактерий (более 107 КОЕ/г) – у 97,0±2,9% обследованных.У детей в возрасте от 1 до 6 месяцев (первая и вторая группы) совместно с K. pneumoniae вегетировали следующие микроорганизмы-симбионты: Enterococcus spp. – в рамках нормативных показателей (105-107 КОЕ/г), однако с гемолитической активностью (ГА) – по 9,1±4,9% в первой и 7,7±4,2% во второй группе; Е. coli с ГА (в 15,1±6,2% и 7,7±4,2% случаев, соответственно); Е. coli с слабой ферментативной активностью (СФА) с частотой встречаемости более 10% от общего количества кишечной палочки у 45,5±8,6% детей первой группы и 46,2±7,9% детей второй группы; S. aureus в 9,1±5,0% и 12,8±5,3% случаев и Clostridium spp. в концентрации более 103 КОЕ/г (15,2±6,2 и 12,8±5,3% случаев, соответственно). У детей третьей группы выделяли Е. coli с ГА (15,2±6,2% случаев), клостридии (более 103 КОЕ/г) и грибы рода Candida (по 9,1±5,0% случаев соответственно). С увеличением возраста у детей с ФН ЖКТ и вегетацией K. pneumoniae частота встречаемости микроорганизмов-ассоциантов в кишечной микробиоте уменьшалась, но появлялись ассоциации клебсиелл и грибов рода Candida (табл. 2).Таблица 2Микробы-ассоцианты, выделенные из кишечника детей первого года жизни с ФН ЖКТ при совместном вегетировании с Klebsiella spp., % Вид микроорганизмаПри выделении штаммов K. pneumoniae (n=105)При выделении штаммов K. oxytoca (n=105)1-3 мес. (n=33)3-6 мес. (n=39)6-12 мес. (n=33)1-3 мес. (n=35)3-6 мес. (n=37)6-12 мес. (n=33)Enterococcus spp. c ГА9,1±5,07,7±4,2008,1±4,49,1±5,0E. coli с ГА15,1±6,27,7±4,215,2±6,28,6±4,713,5±5,630,3±7,9E. coli с СФА45,5±8,6*46,2±7,9*0013,5±5,636,4±8,3*S. aureus9,1±5,012,8±5,3014,3±5,921,6±6,715,2±6,2*Clostridium spp.15,2±6,212,8±5,39,1±5,08,6±4,721,6±6,730,3±7,9*Candida spp.009,1±5,00030,3±7,9*Proteus spp.000009,1±5,0 Примечание: * – показатели статистически значимы (р<0,05) при сравнении групп детей с выделенными видами бактерий – K. pneumoniae и K. oxytoca (t-критерий). При вегетации K. oxytoca в первой группе детей были выделены E. coli c ГА, клостридии – по 8,6±4,7% случаев. В 14,3±5,9% случаев у детей в ассоциации с клебсиеллой был выделен золотистый стафилококк. У детей второй группы K. oxytoca сопутствовали Enterococcus spp. с ГА в 8,1±4,6% случаев, Е. coli с разным спектром свойств: с ГА и СФА (по 13,5±5,6% случаев, соответственно), S. aureus и Clostridium spp. (по 21,6±6,7% случаев). Группа детей 6-12 месяцев характеризовалась присутствием всего спектра выделяемых нами УПМ. Таким образом, при выделении бактерий K. oxytoca c увеличением возраста у детей с ФН ЖКТ статистически значимо увеличивался качественный и количественный состав кишечного микробиоценоза (при р<0,05), что свидетельствует о выраженной кишечной дисфункции у детей первого года жизни (ОСТ).В настоящее время уже накоплены знания о том, что одной из причин увеличения масштабов медицинской значимости УПМ является рост их патогенного потенциала. Бактерии рода Klebsiella могут быть выделены из кишечника 8-10% здоровых взрослых. В тоже время в организме человека клебсиеллы, особенно К. oxytoca, считаются оппортунистическим патогеном, способным вызывать внутрибольничные инфекции у госпитализированных больных, в том числе детей и новорожденных. Доказано, что К. oxytoca может быть этиологическим агентом антибиотик-ассоциированного геморрагического колита (AAHC) у взрослых и подростков [7, 13]. Штаммы К. oxytoca способны производить цитотоксины, участвующие в патогенезе AAHC и обнаруживаются у 69% культур, выделенных от больных ААНС. При этом цитотоксины не были обнаружены у клебсиелл других видов, в том числе и у K. pneumoniae [14]. Кроме того, представители рода Klebsiella являются наиболее часто встречаемыми УПМ, изолируемыми от детей с дисбиотическими нарушениями [8]. Кишечный дисбактериоз, ассоциированный с К. oxytoca, также наблюдается среди детей с целиакией [15].В нашем исследовании состояние микробиоты у детей с ФН характеризовалось значительным микроэкологическим дисбалансом (дисбиоз 3 степени), осложнённым пролиферацией бактерий рода Klebsiella. Эти нарушения не уменьшались с возрастом, а усугублялись присоединением микроорганизмов-ассоциантов, таких как грибы рода Candida (особенно при выделении бактерий K. oxytoca), что может говорить о начале воздействия таких повреждающих факторов как, например, антибактериальная терапия.Анализируя возрастные периоды в течение первого года жизни ребёнка, следует отметить, что, по нашим данным, наиболее критическим у детей с ФН ЖКТ является возраст 3-6 месяцев. Можно предполагать, что дети раннего возраста инфицируются внутрибольничными штаммами клебсиелл в период пребывания в родильном доме, у детей же старшего возраста в связи с ведением прикорма и расширения границ жизнедеятельности происходит смена штаммового состава микрофлоры с заменой внутрибольничных видов на так называемые «дисбиозные» виды. По данным С.А.Егоровой и соавт. [6] генетические маркеры, ассоциируемые с патогенностью истинных возбудителей острых кишечных инфекций, достаточно редко обнаруживаются среди штаммов УПМ, выделенных от взрослых людей. Имеющиеся у семейства Enterobacteriaceae различные фимбриальные и нефимбриальные адгезины способствуют адгезии микроорганизмов к слизи и эпителию кишечного тракта, обеспечивая длительную персистенцию УПМ в кишечнике. Поэтому мы полагаем, что клебсиелл, особенно К. oxytoca, не следует рассматривать как часть нормальной микрофлоры кишечника. Учитывая клиническую картину, следует проводить селективную деконтаминацию этого микроорганизма у детей с дисбиотическими и функциональными нарушениями пищеварения.Таким образом, у детей с ФН ЖКТ наблюдаются дисбиотические нарушения 3 степени, осложнённые пролиферацией бактерий рода Klebsiella, особенно таким диагностически значимым агентом, как K. oxytoca. Воздействие УПМ, их рост и персистенция образует «порочный круг» патологического процесса при развитии ФН ЖКТ у детей первого года жизни. Наиболее критическим для развития ФН ЖКТ у детей первого года жизни является возраст 3-6 месяцев. Длительная персистенция бактерий рода Klebsiella в высоком титре (105-108 КОЕ/г) в толстом кишечнике у детей с ФН ЖКТ диктует необходимость проведения селективной деконтаминации клебсиелл из микробиоценоза кишечника для воздействия на данных бактериальных агентов и, как следствие, разрушения «порочного круга» патологического процесса.