Ханой, Вьетнам
Ханой, Вьетнам
Ханой, Вьетнам
Ханой, Вьетнам
УДК 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Научно-исследовательский институт пищевой промышленности является одним из ведущих научно- исследовательских институтов во Вьетнаме, которые изучают применение микроорганизмов в производстве продуктов питания. Одной из основных целей Института является сбор и поиск новых штаммов для исследований и производства. В рамках этой цели в последние годы Институт фокусируется на продуктах, использующих биомассы микроорганизмов, таких как дрожжевая биомасса, обогащенная цинком и селеном. В данной работе изучение нового штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae A112 для получения высоко-цинкосодержащих препаратов обусловило цель наших исследований, которая заключается в детальном изучении некоторых свойств и стабильности нового штамма Saccharomyces cerevisiae A112 при культивировании его в лабораторных условиях с добавлением соли сульфата цинка. Исследования проводили в Научно-Исследовательском Институте Пищевой Промышленности Вьетнама. Результаты позволили использовать штамм Saccharomyces cerevisiae A112 для получения цинк-обогащенных биомасс дрожжей в промышленном масштабе. Установлено, что штамм S. cerevisiae A112 способен содержать самое большое количество цинка – до 12,88 мг в одном грамме сухой биомассы при добавлении соли сульфата цинка около 1 г/л в питательной среде. Кроме этого, он устойчив к температуре до 35 °С. Оптимальная температура роста принадлежит диапазону: от 28 °С до 33 °С.
Цинк-обогащенная биомасса, дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, цинк, хлебопекарные прессованные дрожжи
Введение
Цинк очень важен для организма, как и другие микроэлементы и витамины. Он обладает ранозаживляющими свойствами. Он нужен для организма, так как в нем нуждаются все ткани и органы человека. Цинк жизненно необходим для развития репродуктивной системы, нормализации гормонального фона, укрепления иммунитета и регенерации. Цинк можно найти в составе более 300 ферментов, в том числе тех, которые участвуют в синтезе ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), сложных эфиров, белков и жиров [1]. Цинк участвует практически во всех стадиях роста клеток. Особый интерес к цинку связан с открытием его роли в нуклеиновом обмене, процессах транскрипции, стабилизации нуклеиновых кислот, белков и особенно компонентов биологических мембран, а также в обмене витамина А [2].
Цинк относится к важным и незаменимым для жизнедеятельности организма человека микроэлементам. Уровень потребления цинка в различных странах варьируется в довольно широких пределах – от 5,5 до 17,4 мг/сут [3]. Для взрослого мужчины рекомендуемая доза применения цинка составляет 15 мг, для детей – 5–10 мг в день, для беременных женщин – около 15 мг в сутки [4].
Недостаток цинка вызывает функциональные и морфологические изменения в деятельности органов и систем [5]. При недостатке цинка будет наблюдаться: снижение аппетита, анемия, аллергические заболевания, частые простуды, дерматиты, снижение массы тела и остроты зрения, а также выпадение волос. Данный элемент увеличивает уровень тестостерона, но при его недостатке будет происходить задержка полового развития мальчиков и потеря активности сперматозоидов для оплодотворения яйцеклетки. Также при недостаточном количестве цинка очень плохо заживают раны и долго восстанавливаются ткани после травм.
Недостаточность микроэлементов часто реги- стрируется в раннем детстве, когда потребность организма в них особенно высока, а пища не всегда содержит их в достаточном количестве. У
70 % детей до 6 лет есть необходимость введе- ния цинка для укрепления иммунитета, костной ткани (особенно у детей, которые не получали грудного кормления). Дети 6–14 лет имеют дефицит в 50 % случаев. У подростков 14–18 лет чаще всего наблюдается дефицит кальция (40 %), магния (50 %) и цинка (30 %) [6].
Главным источником цинка являются зерновые, однако, при их очистке от отрубей содержание цинка значительно снижается. Обогащение цинком пищевых продуктов и полуфабрикатов является актуальной проблемой [7], для решения которой предложен ряд биодобавок. В частности, зарегист- рированы пивные дрожжи, обогащенные цинком [3]. Биомасса дрожжей в современной био- технологии считается источником белка, сбалансированного по незаменимым амино-
кислотам. Биомасса дрожжей является источником белка, витаминов, липидов и других ценных веществ. Дрожжевая биомасса содержит около 44–45 % белка, 25–35 % углеводов, липиды составляют около 1,5–5 %, минералы около 6–12 %. Это доказывает, что пищевая ценность дрожжевой биомассы очень велика. Кроме аминокислот, в дрожжевой биомассе содержится большое количество витаминов группы В [8].
Дрожжи обладают способностью накапливать металлы (Pb, Hg, Cr, Mn, Cu, Zn, Cd и т.д.) в клетках при различных уровнях роста в присутствии этих металлов. Металлы Cu, Zn и Mn оказывают положительное влияние на активность дыхания и темпы роста дрожжей [15]. Большинство видов дрожжей имеет способность накапливать цинк в их биомассе при культивировании с добавлением солей цинка. Но количество цинка, содержащееся в дрожжевой биомассе, различно для разных видов и штаммов дрожжей. Поэтому значительный интерес для дальнейших исследований представляет поиск и изучение новых штаммов, которые способны содержать большое количество цинка в их биомассе. Целью данной работы является изучение в деталях нового штамма S. cerevisiae A112, который выделен из земли во Вьетнаме, для получения
высоко-цинкосодержащих препаратов.
Объекты и методы исследования
Основным объектом является штамм Saccharomyces cerevisiae A112, выделенный из земли, которая собрана в зоне Шонг Конг города Тхай Нгуен Вьетнама. В качестве контрольного штамма, используемого в пищевой промышленности, был выбран штамм S. cerevisiae CNTP 4087 из коллекции центра промышленных микроорганизмов в Научно-исследовательском институте пищевой промышленности (Вьетнам). Указанный штамм обладает способностью эффективно утилизировать моно-, ди- и трисахариды с образованием этилового спирта. Штамм S. cerevisiae CNTP 4087 является типичным штаммом, использующимся для получения цинксодержащих препаратов [9].
Для изучения соотношения штамма S. cerevisiae A112 к различным источникам углеводов использовали ID-32C (Германия) – систему для идентификации дрожжевых грибов.
Тестирования на устойчивость к температуре проводили путем переноса 1 мл культуры дрожжей с помощью пипетки на твердую среду в чашках и инкубировали при различных температурах в течения 48 часов [10].
Для изучения способности обогащения цинком в биомассе пекарские дрожжи выращивали на питательной среде следующего состава (опытный вариант): вода дистиллированная –
1 л; глюкоза – 100 г/л; дрожжевой экстракт
- 3 г/л; пептон – 5 г/л; солодовой экстракт –
3 г/л, в который добавили соль цинка (сульфат цинка) с различными концентрациями соли:
Khanh N.T.M. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2018, vol. 48, no. 4, pp. 114–120
Рисунок 1 – Морфология роста колоний штамма
S. cerevisiae A112 и микроскопическая картина отдельно взятых колоний при световой микроскопии
Figure 1 – The morphology of the growth of colonies of S. cerevisiae A112 strain and the microscopic picture of individual colonies under light microscopy
0,25; 0,5; 1; 1,5; 2,0 г/л. Контрольная среда содержала: вода дистиллированная – 1 л; глюкоза
- 100 г/л; дрожжевой экстракт – 3 г/л; пептон – 5 г/л; солодовой экстракт – 3 г/л. Культивирование проводили в шейкере со скоростью 150 об/мин, при температуре 28 °С и в течение 48 часов.
Для получения сухой биомассы она была высушена при температуре 60 °С в течение
2 часов, потом выдержана при температуре 105 °С до постоянной массы [4]. Биомасса клеток измеряется в граммах сухих веществ/л.
|
H O и разрушили данный образ СВЧ-печью. Далее,
анализировали содержание цинка (длина волны 213,9 нм) [11].
Результаты и их обсуждение
Морфологические признаки. Клетки нового штамма S. cerevisiae A112 имеют типичную форму и размер. Клетки круглые, кругло-овальные, размером 5,0–8,8 мкм. Колонии на солодовом сусло-агаре матовые, гладкие, консистенция пастообразная, цвет кремовый, форма круглая, край ровный, профиль конусообразный, внутренний узор однородный (рис. 1).
В жидком солодовом сусле формируется плотный осадок, кольцо и пленку не образует. Размножается почкованием.
Отношение к источникам углеводов. Для определения видовой принадлежности штамма
S. cerevisiae A112 использовали ID-32C (Германия)
- система для идентификации дрожжевых грибов. Полоска (стрип) ID-32C состоит из 32 лунок, содержащих высушенные субстраты, которые позволяют провести 30 ассимиляционных тестов. Лунки заливали полужидкой минимальной средой. Рост дрожжей в лунке свидетельствует о том, что они способны использовать тот или иной субстрат в качестве единственного источника углерода. Реакции учитывали путем сравнения характера роста с контролем через 24, 48, 96 ч (табл. 1).
Установлено, что дрожжи S. cerevisiae A112 утилизировали глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, Глицерин, D-Маннит, Раффинозу. Отрицательные результаты теста были выявлены на: D-глюкозамине, D-ксилозе, L-арабинозе, D-сорбите, Лактозе, 2-кето-D-Глюконате, Цитрате железа.
Устойчивость к температуре. Устойчивость к повышенной и пониженной температуре является
одной из важнейших характеристик штамма,
2 2
налили дистиллированную воду в колбу с образцом
|
которая может быть в дальнейшем использована в технологическом процессе. Мы изучали устойчивость к температуре нового штамма
S. cerevisiae A112 по сравнению с контрольным
Таблица 1 – Отношение к источникам углеводов штамма S. cerevisiae A112
Table 1 – S. cerevisiae A112 and sources of carbohydrate
|
№ |
Источники углеводов |
Результаты |
|
№ |
Источники углеводов |
Результаты |
|
1 |
D-Глюкоза |
+++ |
|
16 |
Раффиноза |
++ |
|
2 |
D-галактоза |
+ |
|
17 |
Мелезитоза |
– |
|
3 |
L-сорбоза |
+ |
|
18 |
Глицерин |
++ |
|
4 |
D-глюкозамин |
– |
|
19 |
Эритритол |
+ |
|
5 |
Палатиноза |
++ |
|
20 |
D-Маннит |
++ |
|
6 |
D-ксилоза |
– |
|
21 |
Мио-инозитол, |
– |
|
7 |
L-арабинозы |
– |
|
22 |
2-кето-D-Глюконат |
– |
|
8 |
L-рамнозы |
+ |
|
23 |
Молочная кислота |
+ |
|
9 |
Сахароза |
++ |
|
24 |
D-Глюконат |
+ |
|
10 |
Мальтоза |
++ |
|
25 |
Циклогексимид |
+ |
|
11 |
α, α-трегалоза |
+ |
|
26 |
Глюконат Натрия |
+ |
|
12 |
D-сорбит |
– |
|
27 |
Метил α, D-глюкопиранозид |
+ |
|
13 |
Целлобиоза |
– |
|
28 |
Левулиновая кислота |
+ |
|
14 |
Мелибиоза |
+ |
|
29 |
Цитрат железа (ESGulin) |
– |
|
15 |
Лактоза |
– |
|
30 |
Рафинозы |
– |
Кхань Н. Т. М. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 4 С. 114–120
|
0 0,25 0,5 1 1,5 2 |
|
Содержания Zn2+ в сухой биомассе дрожжей (мг/г) |
Таблица 2 – Устойчивость нового штамма S. cerevisiae 20 12
A112 к температуре
Table 2 – S. cerevisiae A112 and its resistance to temperature
15 9
|
5 3
0 0
Концентрации сульфата цинка в питательной среде (г/л)
штаммом S. cerevisiae CNTP 4087. Установлено, что новый штамм S. cerevisiae A112 более устойчив
Содержания Zn2+ в сухой биомассе дрожжей Средний выход сухих дрожжей биомассы
к повышенной температуре (таб. 2). Оптимальная температура роста принадлежит диапазону: от 28 °С до 33 °С. Устойчивость к повышенной температуре производственного штамма можно использовать, повышая температуру брожения. Использование высокотемпературных дрожжей может ускорить ферментацию, снизить риск микробного загрязнения, снизить уровень кислорода, других газов и т. д. [12]. Кроме этого, инвестиционные затраты на охлаждающее оборудование являются экономически выгодными [13,14].
Способность к обогащению цинком биомассы. Для выбора концентрации сульфата цинка новый штамм культивировали в средах с различными концентрациями соли: 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2 г/л. Образцы культивировали в течение 48 часов при температуре 28 °С. Мы выявили, что на рост и количество цинка, содержащегося в биомассе, сильно влияет количество соли (рис. 2). При использовании сульфата цинка в малых концентрациях (0,25 и 0,5 г/л) он незначительно влияет на выход сухой дрожжевой биомассы. Но когда количество соли цинка увеличивается до 1 и 1,5 г/л, выход дрожжевой биомассы начинает уменьшаться в сравнении с контрольным образцом. После добавления 1,5 г/л соли цинка и 48 часов культивирования, получили сухую биомассу 7,8 г/л, что в 1,5 раз меньше, чем в контрольном образце (без добавления сульфата соли). В концентрации
2 г/л соли сульфата биомасса снижается до 0,8 г/л. Это явление можно объяснить тем, что большое количество сульфата цинка уже является отрицательным фактором, который прямо влияет на жизнеспособность дрожжевых клеток. Этот результат соответствует исследованиям авторов К. А. Шомаиех и коллег.
Концентрация соли цинка также сильно влияет на содержание цинка в дрожжевой биомассе. Чем больше количество сульфата цинка добавляется в среду, тем больше количество цинка содержится в биомассе. После 48 часов культивирования содержание цинка в биомассе достигало 15,95 мг/г при добавлении 2 г/л сульфата цинка и в культивированной среде.
Рисунок 2 – Влияние концентрации сульфата цинка на выход биомассы и содержание цинка в дрожжевой биомассе штамма S. cerevisiae A112
Figure 2 – The effect of zinc sulphate concentration on biomass yield and zinc content in S. cerevisiae A112 yeast biomass
Результаты исследования выявили, что для получения большого количества выхода биомассы с большим количеством содержания цинка нужно выбрать концентрацию сульфата цинка 1 г/л.
Стабильность нового штамма S. cerevisiae A112 при культивировании в биореакторе объема 20Л Solaris (Италия). Культуру штамма S. cerevisiae CNTP 4087 и S. cerevisiae A112 культивировали в биореакторе при одних и тех же условиях: при температуре 28 °С в течение 48 часов с добавлением 1 г/л сульфата цинка и со скоростью перемешивания 150 об/мин.
Результаты показывают, что при куль- тивировании в биореакторе 20Л оба штамма хорошо развивались. Самый большой выход биомассы после 48 часов культивирования достигал 10,6 г/л для штамма S. cerevisiae CNTP 4087 и 13,0 г/л для штамма S. cerevisiae A112. Выход
|
Средний выход сухой дрожжевой биомассы (г/л) |
12
8
4
0
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Время культивирования (час)
CNTP 4087 A112
Рисунок 3 – Выход дрожжевой биомассы штаммов
S. cerevisiae CNTP 4087 и S. cerevisiae A112 при культивировании в биореакторе 20Л
Figure 3 – Yeast biomass yield of S. cerevisiae CNTP 4087
and S. cerevisiae A112 strains when cultured in a 20-litre bioreactor
Khanh N.T.M. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2018, vol. 48, no. 4, pp. 114–120
|
0 6 12 18 24 32 38 42 48 |
|
Содержание Zn2+ в сухой биомассе дрожжей (мг/кг) |
14 следует, что данный штамм способен эффективно утилизировать моно-, ди- и трисахариды. Hовый
12 штамм S. cerevisiae A112 устойчив к повышенной
10 температуре. Оптимальная температура роста принадлежит диапазону от 28 °С до 33 °С.
8 Биомасса штамма S. cerevisiae A112 обладает
6 способностью адсорбировать цинк. Чем большее количество соли цинка добавляется в
4 питательную среду, тем большее количество
2 цинка содержится в биомассе. Когда концентрация
0 сульфата цинка в питательной среде меньше 1 г/л он незначительно влияет на выход дрожжевой
|
Время культивирования (час) |
|
S. cerevisiae CNTP 4087 |
|
S. cerevisiae A112 |
биомассы. Концентрация сульфата цинка более
|
|
Рисунок 4 – Содержание цинка в сухой биомассе дрожжей при культивировании в биореакторе объема 20Л
Figure 4 – Zinc content in dry yeast biomass when cultivated in a
20-litre bioreactor
биомассы у нового штамма A112 даже лучше, чем у контрольного штамма S. cerevisiae CNTP 4087.
Далее мы рассмотрели, как содержание цинка в биомассе дрожжей изменяется при культивировании в биореакторе в течение 48 часов. Немного различий между полученными количествами цинка в биомассе штаммов S. cerevisiae CNTP 4087 и
S. cerevisiae A112 при культивировании в биореакторе 20Л. Самое большое количество цинка в биомассе получено 9,35 мг/г для
- cerevisiae CNTP 4087 и 12,88 мг/г для S. cerevisiae
A112.
Выводы
По результатам изучения некоторых типичных свойств нового штамма S. cerevisiae A112
20Л новый штамм S. cerevisiae A112 показал, что он стабильный в культивируемых условиях. Поэтому его возможно использовать в производстве в промышленном масштабом.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Благодарности
Выражаем благодарность и глубокую признательность всем сотрудникам Центра промышленной биохимии и экологии НИИ пищевой промышленности за помощь и советы при работе над данной статьей.
Финансирование
Материалы подготовлены в рамках выполнения научных исследований, осуществляемых НИИ пищевой промышленности в соответствии с Вьетнамским государственным заданием № DTDL CN-59/15
1. De Nicola, R. Interaction between Yeasts and Zinc / R. De Nicola, G. Walker // Yeast Biotechology: Diveristy and Applications / T. Satyanarayana, G. Kunze. - Dordrecht : Springer, 2008. - P. 237-257. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4020- 8292-4_12.
2. Selenium in biology: Facts and medical perspectives / J. Kohrle, R. Brigelius-Flohe, A. Block [et al.] // Biological Chemistry. - 2000. - Vol. 381, № 9-10. - P. 849-864. DOI: https://doi.org/10.1515/BC.2000.107.
3. Обогащение дрожжей солями цинка / Е. В. Будко, А. И. Конопля, А. А. Хабаров [и др.] // Научные Ведомости Белгородского Государственного Университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2012. - Т. 129, № 10-3. - С. 90-93.
4. Azad, S. K. Production of zinc-enriched biomass of Saccharomyces cerevisiae / S. K. Azad, F. Shariatmadari, M. A. K. Torshizi // Journal of Elementology. - 2014. - Vol. 10, № 2. - P. 313-326. DOI: https://doi.org/10.5601/ jelem.2014.19.2.655.
5. Importance of the structural zinc atom for the stability of yeast alcohol dehydrogenase / E. Magonet, P. Hayen, D. Delforge [et al.] // Biochemical Journal. - 1992. - Vol. 287, № 2. - P. 361-365. DOI: https://doi.org/10.1042/bj2870361.
6. Рустембекова, С. А. Элементный портрет человека - золотой стандарт диагностики / С. А. Рустембекова // Натуральная фармакология и косметология. - 2006. - № 3.
7. Обоснование уровня обогащения пищевых продуктов витаминами и минеральными веществами / В. М. Коденцова, О. А. Вржесинская, В. П. Спиричев [и др.] // Вопросы питания. - 2010. - Т. 79, № 1. - С. 23-33.
8. Phẩm, N. Đ. Nấm men công nghiệp / N. Đ. Phẩm. - Hàội : NXB Khoa học và kỹ thuật, 2009. - P. 46-52.
9. Thành, V. N. Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm / V. N. Thành. - Hànội : Viện Công nghiệp thực phẩm, 2012. - P. 57-64.
10. Новый штамм дрожжей для пивоварения: Свойства и преимущества / С. Г. Давыденко, Б. Ф. Яровой, В. П. Степанова [и др.] // Генетика. - 2010. - Т. 46, № 11. - С. 1473-1484.
11. Enrichment of Saccharomyces cerevisiae with zinc and their impact on cell growth / A. R. Shet, L. R. Patil,V. S. Hombalimath [et al.] // Journal of Biotechnology, Bioinformatics and Bioengineering. - 2011. - Vol. 1, № 4. - P. 523-527.
12. Roehr, M. The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications / M. Roehr // Weicheim : Wiley-VCH, 2001. - P. 244.
13. Limtong, S. Production of fuel ethanol at high temperature from sugar cane juice by a newly isolated Kluyveromyces marxianus / S. Limtong, C. Sringiew, W. Yongmanitchai // Bioresources Technology. - 2007. - Vol. 98, № 17. - P. 3367-3374. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2006.10.044.
14. High-temperature fermentation: How can processes for ethanlo production at high temperatures become superior to the tranditional process using mesophilic yeast / B. M. A. Abdel-Banat, H. Hoshida, A. Ano [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. 2010. - Vol. 85, № 4. - P. 861-867. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-009-2248-5.
15. Nghiên cứ khả năng hấp thu một số kim loại nặng (Cu2+, Pb2+, Zn2+) trong nước của nấm men Saccharomyces cerevisiae / N. T. Hà, T. T. Hồng, N. T. T. Nhàn [et al.] // Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. - 2007. - Vol. 23, № 2. - P. 99-106.
