Диагностика инфекционных заболеваний является одной из сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в плане диагностики, но и в определении конечного исхода заболевания. Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов. При этом бактериологическая группа методов является одной из трёх ведущих в диагностике инфекционных заболеваний [1, 2, 3, 4]. Одним из важных элементов в лабораторной диагностике острых кишечных инфекций (ОКИ) и оппортунистических инфекций, вызванных энтеробактериями, является выделение возбудителя в чистой культуре на питательных средах [5, 6, 7]. В связи с этим совершенствование рецептуры питательных сред, предназначенных для выделения и дифференциации условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, является актуальным и практически значимым. Цель исследований − cовершенствование рецептуры питательной среды Drigalski Lactose Agar производства компании AppliChem, предназначенной для выделения и дифференциации энтеробактерий.  Задачи исследований − разработать новую рецептуру питательной среды Drigalski Lactose Agar; определить эффективность культивирования энтеробактерий на применяемых в лабораторной практике питательных средах и на усовершенствованной авторами среде Drigalski Lactose Agar.   Материал и методы исследований. Объект исследований – модифицированная авторами дифференциально-диагностическая коммерческая питательная среда, предназначенная для выделения и дифференциации патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, а также для проведения санитарно-бактериологического исследования. Материал для исследований – 253 изолятов бактерий, выделенных из кишечного микробиотопа различных видов животных. Сельскохозяйственные животные: коровы, овцы, козы, свиньи, лошади, птица (куры и гуси). Дикие животные: кабаны, лоси, лисы. Зоопарковые животные: пони, верблюд. Домашние животные: кошки и коты, собаки, хорьки, шиншиллы. Исследование проводили в период с 2010 по 2017 гг. Суспензию биоматериала для получения роста культур бактерий высевали на дифференциально-диагностические и селективно-элективные питательные среды. Суспензию биоматериала высевали на питательный агар с эозинметиленовым синим Левина, на среду Drigalski Lactose Agar, производства компании AppliChem, на новую среду, приготовленную по разработанной авторами рецептуре. Наряду с перечисленными средами, эшерихии выделяли на средах Эндо и кровяном агаре.  Протеи выделяли на агаре П-1 с полимиксином и солями желчных кислот, на скошенном мясо-пептонном агаре (МПА) и кровяном МПА, клебсиеллы выделяли на агаре Плоскирёва и кровяном МПА. Сальмонеллы выделяли на висмут-сульфитном агаре и железо-сульфитном агаре, в селенитовой среде Leifson (коммерческой и модифицированной), а также в магниевой среде, тетротионатовой среде Мюллера и среде Мюллера-Кауфмана, на сальмонелла-шигелла агаре. Иерсинии выделяли на дифференциально-диагностическом СБТС-агаре и селективном CIN-агаре, на глюкозо-кровяном агаре, морганеллы – на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, гафнии – на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, эрвинии – на агаре Плоскирева и глюкозо-кровяном агаре, энтеробактеры –  на  эозинметиленовом агаре, серрации – на пептон-глицериновом агаре, клюйверы – на глюкозо-кровяном агаре, цитробактеры – на висмут-сульфитном агаре и агаре Плоскирева, провиденции – на глюкозо-кровяном агаре, шигеллы выделяли на сальмонелла-шигелла агаре. Суспензию материала распределяли одноразовым стерильным микробиологическим г-образным шпателем по поверхности среды в чашке Петри и инкубировали в термостате при 25-300С, 370С 48-72 ч [8]. Чистые культуры микроорганизмов идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам. Подсчёт количества выросших колоний микроорганизмов (КОЕ – колониеобразующая единица) на плотных питательных средах проводили общепринятым методом на приборе ПСБ (прибор счёта бактерий).Эффективность культивирования энтеробактерий на применяемых в лабораторной практике питательных средах и на усовершенствованной среде Drigalski Lactose Agar, приготовленной по новой рецептуре определяли по времени появления колоний микроорганизмов и накопления, достаточного для идентификации биоматериала.   Результаты исследований обрабатывали статистически по общепринятой методике с использованием компьютерной программе Microsoft Excel.Результаты исследований. Работа выполнена на базе кафедры «Эпизоотология, патология и фармакология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Самарская государственная сельскохозяйственная академия» за период с 2010 по 2017 гг. В течение первого этапа исследований проводили выделение, культивирование и идентификацию культур энтеробактерий, полученных от различных видов животных. В ходе второго этапа проводили анализ рецептур питательных микробиологических сред для энтеробактерий, сред обогащения и дифференциально-диагностических сред. Осуществляли подбор питательной основы и формообразователя, стимуляторов роста, углеводов, индикатора, селективных компонентов и ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры для модификации агара Дригальского с лактозой (Drigalski Lactose Agar, AppliChem A5731,0500). Материал исследований – 253 изолята энтеробактерий, выделенные из кишечного микробиотопа различных видов животных. Объект исследований – разработанная новая рецептура дифференциально-диагностической питательной среды  Drigalski Lactose Agar с селективной добавкой. Рецептура среды Drigalski Lactose Agar производства компании AppliChem имеет следующий состав (г/л): пептон 15,0 г, мясной экстракт 3,0 г, дрожжевой экстракт 3,0 г, дезоксихолат натрия 1,0 г, натрия тиосульфат 1,0 г, лактоза 15,0 г, кристаллический фиолетовый 0,005 г, бромтимоловый синий 0,08 г, агар 11,0 г.  Среда имеет pH 7,3±0,2. Выделение, культивирование и идентификация культур энтеробактерий. Суспензию биоматериала (фекалии животных) для получения роста культур энтеробактерий высевали на дифференциально-диагностические и селективно-элективные питательные среды. Суспензию биоматериала распределяли одноразовым стерильным микробиологическим г-образным шпателем по поверхности среды в чашке Петри и инкубировали в термостате при 25-300С, 370С  48-72 ч, в зависимости от выделяемой культуры энтеробактерий [8]. Чистые культуры энтеробактерий идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам. Подсчёт количества выросших колоний микроорганизмов (КОЕ – колониеобразующая единица) на плотных питательных средах проводили общепринятым методом на приборе ПСБ (прибор счёта бактерий). Результаты исследований обрабатывали статистически по общепринятой методике с использованием PC Pentium с помощью приложения Microsoft Office 2003 Excel-7.Результаты исследований. В ходе создания новой рецептуры Drigalski Lactose Agar проводился подбор питательной основы и формообразователя питательной среды. В качестве агаровой основы для модификации лактозного агара использовали агар бактериологический сухой производства ФБУН ГНЦ МПБ Оболенск (Россия). В ходе выбора питательной основы и стимуляторов роста учитывали полноценность компонентов по набору питательных веществ и их доступность для микроорганизмов. С целью обогащения питательной основы высокомолекулярными пептидами в рецептуру среды ввели пептон ферментативный бактериологический с высоким содержанием триптофана производства HiMedia Laboratories (Индия). Пептон, полученный путём ферментативного гидролиза с использованием пепсина и трипсина, содержит большое количество высокомолекулярных пептидов и аминокислот. В качестве стимуляторов роста энтеробактерий в рецептуру питательной среды решено было ввести аминопептид, экстракт хлебных дрожжей. В ходе выбора минеральных компонентов учитывали потребность в них энтеробактерий, взаимодействие их с другими компонентами среды, предполагаемую диагностическую информативность и ингибирующий эффект на сопутствующую микрофлору. Натрия хлорид необходим для создания изоосмотических условий среды, оптимально подходящих для роста и размножения микроорганизмов. Натрия хлорид ингибирует рост сопутствующих грамположительных стрептококков.Углеводы ввели в рецептуру среды для дифференциации энтеробактерий по признаку ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и маннита. Углеводы лактоза и маннит входят в пропись А среды, а глюкоза и сахароза включены в пропись Б среды. Углеводы служат наилучшим источником углерода для большого спектра микроорганизмов.Желатин решено ввести в рецептуру среды с целью выявления протеолитической активности у энтеробактерий, в частности у представителей рода Proteus. Краситель фуксин основной необходим для дифференциации энтеробактерий, ферментирующих главным образом лактозу.В качестве индикатора были выбраны доступные и наиболее часто используемые в рецептурах дифференциально-диагностических питательных сред индикатор Андреде с индикатором ВР. В состав индикатора Андреде входит фуксин кислый, гидроксид натрия 1N и дистиллированная вода. Комбинированный индикатор ВР состоит из водного голубого и розоловой кислоты (аурин, пэонин или красный кораллин).В качестве селективных ингибиторов роста сопутствующей микрофлоры решено использовать антибиотики, находящиеся в селективной добавке к среде.   Таким образом, рецептура модифицированного лактозного агара имеет состав, состоящий из двух прописей А и Б (табл. 1).Работа с модифицированной питательной средой предусматривает использование двухсекционных одноразовых чашек Петри. При этом можно использовать также многоразовые стеклянные чашки Петри с перегородкой, делящей чашку на две равные секции. В одну секцию наливают компонент А модифицированного лактозного агара, в другую секцию разливают компонент Б.  Таблица 1Новая рецептура питательной среды Drigalski Lactose AgarКомпоненты средыПропись А (г/дм3)Пропись Б (г/дм3)Агар бактериологический12,012,0Панкреатический гидролизат рыбной муки5,05,0Панкреатический гидролизат казеина5,05,0Пептон ферментативный бактериологическийс высоким содержанием триптофана5,05,0Аминопептид2,02,0Экстракт хлебных дрожжей2,02,0Желатин0,50,5Натрия хлорид5,05,0Натрия карбонат0,50,5Натрия сульфит0,50,5Натрия тиосульфат0,30,3Железо (II) сульфат1,01,0УглеводЛактоза 10,0Глюкоза 10,0УглеводМаннит 7,0Сахароза 7,0Фуксин основной1,01,0Индикатор Андреде с индикатором ВР0,20,2 Выявление эффективности питательных дифференциально-диагностических сред с селективным эффектом проводилось согласно времени, необходимом для образования на средах колоний энтеробактерий семейства Enterobacteriaceae 1-3 мм в диаметре. Время культивирования энтеробактерий, выделенных от сельскохозяйственных животных, составило от 18,28±1,56 до 33,28±3,58 ч (табл. 2), а от диких животных ‒ от 16,28±1,44 до 33,74±4,14 ч (табл. 3).Таблица 2Время культивирования энтеробактерий, выделенных от сельскохозяйственных животныхКультурыэнтеробактерийВремя культивирования, чЭндо агарDrigalski Lactose Agar,производства компании AppliChemНовая рецептура Drigalski Lactose AgarEscherichia coli22,82±1,1222,56±0,7420,34±0,85Salmonella Enteritidis28,34±3,2626,14±1,8420,76±1,12Klebsiella oxytoca26,54±2,3227,44±1,8222,28±0,94Proteus vulgaris30,48±2,6428,16±2,3223,14±1,22Providencia alcalifaciens33,28±3,5829,18±2,6621,52±1,35Hafnia alvei28,56±2,7427,36±2,5222,54±1,26Morganella morganii28,66±2,5226,18±2,3620,58±1,64Enterobacter cloacae27,58±2,4426,64±1,8818,66±0,78Citrobacter freundii28,26±2,6627,12±2,5223,75±1,88Serratia marcescens25,74±2,7827,48±2,3822,68±1,32Erwinia amylovora32,58±3,4230,22±2,1425,72±1,34Kluyvera cryocrescens26,38±2,8824,58±2,2221,25±1,36Yersinia enterocolitica23,76±1,3420,36±1,7818,28±1,56 Таблица 3Время культивирования энтеробактерий, выделенных от диких животныхКультурыэнтеробактерийВремя культивирования, чЭндо агарDrigalski Lactose Agar,производства компании AppliChemНовая рецептура Drigalski Lactose Agar1234Escherichia coli21,32±0,7520,14±1,1216,28±1,44Shigella dysenteriae28,56±2,1625,32±1,7423,38±1,52Shigella flexneri33,42±1,7228,33±2,0826,76±1,88Salmonella Enteritidis25,56±1,1823,88±1,3620,44±1,06Klebsiella oxytoca27,38±1,8427,17±2,0823,14±1,76Proteus vulgaris28,44±1,5726,12±1,8822,86±1,12Providencia alcalifaciens28,87±2,1827,30±1,9418,59±2,04Hafnia alvei27,30±1,6825,22±1,6020,34±0,94Окончание табл. 31234Morganella morganii26,88±1,7824,56±1,8022,33±1,26Enterobacter cloacae29,18±1,3324,28±1,6619,52±1,34Citrobacter freundii26,08±1,8225,88±1,0620,55±1,38Serratia marcescens27,34±1,6625,29±1,4320,83±1,90Erwinia amylovora30,73±2,0627,12±1,8324,68±1,78Kluyvera cryocrescens28,77±4,6727,89±3,8825,08±2,13Yersinia enterocolitica22,74±0,9519,64±1,1316,56±0,82 Время культивирования энтеробактерий, выделенных от зоопарковых животных, составило от 17,06±3,78 до 36,52±2,08 ч (табл. 4), а от домашних животных составило от 18,72±2,32 до 42,18±4,12 ч (табл. 5).Таблица 4Культивирование энтеробактерий, выделенных от зоопарковых животныхКультурыэнтеробактерийВремя культивирования, чЭндо агарDrigalski Lactose Agar,производства компании AppliChemНовая рецептура Drigalski Lactose AgarEscherichia coli19,04±1,1420,32±1,2221,86±1,52Shigella dysenteriae30,24±1,6227,52±1,3825,08±1,08Shigella flexneri28,15±2,3228,08±2,1626,43±2,76Salmonella Enteritidis25,24±1,8622,44±2,3425,42±2,89Klebsiella oxytoca25,44±2,6528,06±2,5526,22±1,94Proteus vulgaris30,28±3,6528,18±2,3830,66±1,24Providencia alcalifaciens29,76±1,3436,52±2,0831,76±2,87Hafnia alvei26,78±1,0830,54±2,1227,88±2,56Morganella morganii28,55±2,7627,16±3,8830,56±2,98Enterobacter cloacae20,86±3,1225,65±2,7826,45±3,08Citrobacter freundii26,89±2,6725,98±3,1827,12±3,56Serratia marcescens26,39±3,2228,87±2,9025,76±2,89Erwinia amylovora23,34±1,7226,30±2,1527,88±5,32Kluyvera cryocrescens27,44±2,5424,12±1,6228,78±3,76Yersinia enterocolitica25,88±3,6517,06±3,7821,83±1,66 Таблица 5Культивирование энтеробактерий, выделенных от домашних животныхКультурыэнтеробактерийВремя культивирования, чЭндо агарDrigalski Lactose Agar,производства компании AppliChemНовая рецептура Drigalski Lactose AgarEscherichia coli22,32±2,0826,46±2,5818,72±2,32Shigella dysenteriae38,66±2,7439,56±2,6433,45±2,45Shigella flexneri32,78±1,8636,44±2,8226,08±1,62Salmonella Enteritidis30,44±2,7026,86±1,5220,34±1,08Klebsiella oxytoca36,68±1,3230,18±1,1422,74±2,94Proteus vulgaris38,62±2,4026,14±2,5622,18±1,06Providencia alcalifaciens38,08±3,4435,74±3,8426,74±1,10Hafnia alvei30,04±2,6427,44±3,8824,16±1,22Morganella morganii29,89±3,1825,88±4,6825,90±3,70Enterobacter cloacae26,12±2,7828,70±1,4423,80±1,68Citrobacter freundii30,96±3,7428,52±3,5625,08±1,73Serratia marcescens33,94±2,1830,18±3,3420,56±1,96Erwinia amylovora38,08±3,6437,12±3,4824,62±2,06Kluyvera cryocrescens42,18±4,1238,68±3,0826,50±2,46Yersinia enterocolitica36,26±2,1830,48±2,8221,80±1,42 Видовой состав энтеробактерий, выделенных от различных видов животных, состоял из представителей семейства Enterobacteriaceae: Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Providencia, Hafnia, Morganella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Erwinia, Kluyvera, Yersinia. Доля патогенных энтеробактерий у животных была не значительной: Salmonella Enteritidis (0,012-0,24%), Shigella dysenteriae и Shigella flexneri (0,003-0,01%), Klebsiella oxytoca (2,44-3,12%), Yersinia enterocolitica (0,04-0,12%). При этом шигеллы не были выделены у сельскохозяйственных животных.Новая рецептура питательной среды Drigalski Lactose Agar имеет следующий состав (г/дм3): агар бактериологический ‒ 12,0,  панкреатический гидролизат рыбной муки ‒ 5,0, панкреатический гидролизат казеина ‒ 5,0, пептон ферментативный бактериологический с высоким содержанием триптофана ‒  5,0, аминопептид ‒ 2,0, экстракт хлебных дрожжей ‒ 2,0, желатин ‒ 0,5, натрия хлорид ‒ 5,0, натрия карбонат ‒ 0,5, натрия сульфит ‒ 0,5, натрия тиосульфат ‒ 0,3, железо (II) сульфат ‒ 1,0, фуксин основной ‒  1,0, индикатор Андреде с индикатором ВР ‒ 0,2. Среда готовится по прописи А и Б. В прописи А содержится лактоза ‒ 10,0 и маннит ‒ 7,0 (г/дм3), а в прописи Б содержится глюкоза ‒ 10,0 и сахароза ‒ 7,0 (г/дм3). Дифференциация энтеробактерий, культивируемых на среде, изготовленной по данной рецептуре, проводится по их способности ферментировать лактозу, маннит, глюкозу, сахарозу, желатин и образовывать сероводород. Среда может также использоваться для проведения санитарно-микробиологического исследования объектов окружающей среды. Среда может быть использована для проведения ONPG-теста. Эффективность культивирования энтеробактерий, выделенных от различных видов животных, на наиболее часто применяемых дифференциально-диагностических средах, в том числе с использованием новой рецептуры среды  Drigalski Lactose Agar, составляла от 16,28±1,44 до 42,18±4,12 ч. Энтеробактерии, выделенные  от сельскохозяйственных и диких животных, образовывали колонии на модифицированном агаре Дригальского с лактозой в течение 24 ч, а энтеробактерии, выделенные от зоопарковых животных, в течение 25-31 ч. Энтеробактерии, выделенные от домашних животных, образовывали колонии на модифицированном агаре в течение 18-27 ч. В результате культивирование с применением новой рецептуры среды  Drigalski Lactose Agar с селективной добавкой позволяет сократить время культивирования энтеробактерий, выделенных от различных видов животных.Заключение. Новая рецептура питательной среды Drigalski Lactose Agar содержит оптимальный набор веществ, удовлетворяющий ростовые потребности энтеробактерий, и позволяет сократить время на выделение и дифференциацию условно-патогенных и патогенных энтеробактерий.