Введение. Эфирные масла лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.) применяют в производстве мыла, парфюмерии, пищевых ароматизаторов и других продуктов, а также в медицине, как противомикробные агенты [1]. Ее широко используют как декоративное и медоносное растение. Для производства саженцев лаванды зачастую используют метод зеленого черенкования [2]. Наряду с традиционными методами размножения этой культуры активно разрабатывают приемы клонального микроразмножения разных видов рода Lavandula [3, 4, 5]. Однако преимущественно все эти работы посвящены оптимизации состава питательных сред для разных этапов размножения in vitro, а вопросы адаптации затронуты в единичных публикациях [6, 7]. Основной проблемой широкого распространения технологии культуры тканей считают высокую себестоимость продукции. Разработанный протокол клонального микроразмножения для получения микрорастений должен включать экономически обоснованные условия для проведения всех этапов размножения in vitro [8]. Трудности, возникающие во время закаливания и акклиматизации, считают одними из основных проблем, неблагоприятно влияющими на масштабирование технологий размножения in vitro [9].Вопросы клонального микроразмножения, касающиеся адаптации ex vitro растений после длительного субкультивирования, изучены весьма фрагментарно. Однако это важный вопрос, так как от способности размноженных микрорастений сохранять свой регенерационный потенциал зависит эффективность всей методики микроразмножения in vitro [10, 11].Для L. angustifolia ранее была показана относительная стабильность коэффициента размножения вплоть до 9-го пассажа, с увеличением его в 3…4 субкультивировании [12]. В работах Н. А. Егоровой с соавторами не отмечено снижения ризогенной способности лаванды узколистной по мере культивирования, при этом в течение 12 пассажей частота укоренения варьировала незначительно [13]. В нашей предыдущей работе [14] оценены микрорастения лаванды сорта Синева в процессе адаптации, полученные после 4…8-ми субкультивирований. Достоверных различий между пассажами по массе микрорастений, параметрам фотосинтетической активности не установлено и показана возможность успешной адаптации ex vitro микрорастений.Также при оценке генетической стабильности трех сортов лаванды узколистной при длительном (до 16 субкультивирований) клональном микроразмножении с использованием RAPD и ISSR маркеров не установлено какого-либо полиморфизма между растениями одного сорта [15]. Настоящее исследование представляет интерес не только для анализа эффективности длительного микроразмножения растений лаванды при получении качественного посадочного материала, но и для возможного поддержания коллекций in vitro в обычных условиях культивирования при 26 оС.Цель исследований – выявление особенностей адаптации к условиям ex vitro растений лаванды после длительного клонального микроразмножения. Условия, материалы и методы. Эксперименты выполняли на микрорастениях лаванды узколистной (Lavandula angustifolia Mill.) сорта Синева, полученных после 8, 11, 12, 14, 15 и 16 субкультивирований, в процессе их адаптации ex vitro. Микроразмножение in vitro.Для соблюдения условий асептики с первого по третий этапы микроразмножения in vitro все работы выполняли в условиях бокса БАВнп-01-«Ламинар-С»-1,2 (Россия). Основные этапы клонального микроразмножения (введение в культуру, собственно микроразмножение, укоренение in vitro) осуществляли с использованием ранее разработанных модификаций питательной среды Мурасиге и Скуга (МС) [5]. При введении в культуру in vitro пазушные меристемы с двумя листовыми примордиями помещали на среду МС, содержащую 1,0 мг/л кинетина (Кин.) и 0,5 мг/л гибберелловой кислоты (ГК3) («Sigma», США). На этапе собственно микроразмножения в качестве эксплантов использовали сегменты стебля с одним узлом, полученные при микрочеренковании побегов, которые культивировали 35…40 суток на среде МС с 0,5 мг/л Кин. и 0,1 мг/л ГК3. Для укоренения микрочеренки с 1 узлом культивировали 45 суток на среде ½МС с добавлением 0,5 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК). Микрорастения с хорошо развитыми побегами и 3…6 корнями извлекали из питательной среды и после промывания корней помещали в пластиковые стаканы объемом 200 мл с автоклавированным субстратом, состоящим из 50 % торфа с нейтральной pH и 50 % перлита.Высаженные микрорастения накрывали прозрачными стаканами, для обеспечения высокой влажности (90…95 %) в течение первых 7…10 суток, а затем постепенно открывали для акклиматизации к условиям культуральной комнаты с влажностью воздуха 70 %, освещенностью 2…3 кЛк, продолжительностью фотопериода 16 ч, температурой 24±2 оС.Микрорастения по мере подсыхания субстрата поливали раствором Кнопа. При адаптации учеты и наблюдения осуществляли на 14, 30, 45 и 60 сутки после переноса в условия ex vitro. Количество растений в каждом субкультивировании – n=10 шт., повторность 3-х кратная. Физиологические исследования.Оценку хлорофилла (a, b и общего количества) и содержания каротиноидов выполняли на пяти случайным образом отобранных микрорастениях на 14, 30, 45 и 60 сутки после высадки в субстрат. Оценку содержания пигментов фотосинтеза выполняли методом спекторофотометрии на приборе Экрос ПЕ-5300ви из спиртовой вытяжки [16].Оценку функционального состояния растений лаванды выполняли на приборе LPT-1FCU (Россия). Учитывали индекс жизнеспособности (Fm/F_T) и коэффициент фотосинтетической активности (Kf_n) [17]. На 30, 45 и 60 сутки выращивания учитывали массу корневой системы и надземной вегетативной части растений (n=5 растений). Статистический анализ.Достоверность различий оценивали тестом Дункана на 5 %-ном уровне значимости, применяли корреляционный анализ, оценивали размах дисперсии и квартилей распределения признаков. Данные в таблицах представлены в виде среднего и стандартной ошибки, на графиках – доверительные интервалы.Результаты и обсуждение. Как показано в нашей предыдущей работе, после 8-ми субкультивирований при микроразмножении происходит стабилизация морфометрических показателей, по сравнению с более ранними субкультивированиями [14]. Частота адаптации микрорастений, полученных после 4…16 субкультивирований составляла 83…100 % (рис. 1). Рисунок 1 – Влияние количества субкультивирований на частоту адаптации миуроарстений лаванды к услвоиям ex vitro. Согласно результатам двухфакторного дисперсионного анализа на рост и развитие микрорастений лаванды влияли как длительность адаптации (фактор А) и количество субкультивирований (фактор B), так и взаимодействие этих двух факторов (A×B). Как и предполагалось доля влияния длительности адаптации была больше – 76…90 %, при достоверном влиянии количества субкультивирований – 4…9 %, и взаимодействия факторов А и B – 4…15 % (табл. 1).  Таблица 1 – Результаты дисперсионного анализа влияния длительности адаптации и количества субкультивирования in vitro на морфологические показатели микрорастений при адаптации ex vitroИсточник варьированияSSСтепениMSFpКоличество дополнительных побеговДлительность адаптации3548,06*31182,69*202,67*0,000*Количество субкультивирований234,02*546,80*8,02*0,000*Длительность адаптации×количество субкультивирований156,09*1510,41*1,78*0,035*Длина основного побегаДлительность адаптации983039,54*3327679,85*230,90*0,000*Количество субкультивирований54461,88*510892,38*7,68*0,000*Длительность адаптации×количество субкультивирований86173,23*155744,88*4,05*0,000*Количество узлов на основном побегеДлительность адаптации10039,63*33346,54*221,55*0,000*Количество субкультивирований418,18*583,64*5,54*0,000*Длительность адаптации×количество субкультивирований1151,44*1576,76*5,08*0,000*Количество узлов на дополнительном побегеДлительность адаптации1534,99*2767,49*171,99*0,000*Количество субкультивирований178,71*535,74*8,01*0,000*Длительность адаптации×количество субкультивирований308,45*1030,85*6,91*0,000**достоверно на уровне значимости p≤0,05. Количество основных побегов не зависело от количества субкультивирований и длительности адаптации и составляло 1–2 шт. Отмечали тенденцию уменьшения количества дополнительных побегов с увеличением количества субкультивирований, однако она не нашла статистического подтверждения. До 45 суток адаптации достоверных отличий между количествами субкультивирований по длине побега не отмечали и на 14 сутки она составляла от 44,24 мм в 12 пассаже до 63,46 мм в 8 пассаже, на 30 сутки – от 91,07 мм до 125,15 мм в тех же пассажах. По величине этого показателя на 45 сутки адаптации микрорастения, полученные после 8 и 11 субкультивирований, были выше на 10…34 %, чем после 12…16 субкультивирований. На 60 сутки адаптации по величине этого показателя лучшими так же оказались микрорастения после 8 субкультивирований (206,73 мм), что выше, чем после 14, 15 и 16 пассажей на 21…28 %. По длине дополнительных побегов закономерностей в зависимости от количества субкультивирования не отмечено. По количеству узлов на основном побеге отмечали тенденцию к их уменьшению с увеличением количества пассажей. Длина побегов в зависимости от количества субкультивирований увеличилась относительно 14 суток адаптации на 30 сутки в 1,9…2,0 раза, на 45 сутки – в 2,3…2,6 раза, 60 сутки – 2,6…4,2 раза (табл. 2, рис. 2). Таблица 2 – Влияние длительности субкультивирования и адаптации ex vitro на морфометрические показатели микрорастений лавандыКоли-чество суб-культи-вирова-нийКоличество побегов, шт.Длина побега, ммКоличество узлов, шт./побегосновныхдополнитель-ныхосновногодополнительногоосновном побегедополнительном побеге14 суток адаптации81,25±0,08а0±0a63,46±4,28 abc0±0a8,97±0,52 abcde0±0a111,14±0,08а0±0a59,13±3,25 abc0±0a7,97±0,46abc0±0a121,32±0,13а0±0a44,24±3,79a0±0a6,70±0,52ab0±0a141,16±0,07а0±0a57,72±4,43 abc0±0a7,14±0,54 abc0±0a151,19±0,08а0±0a54,69±3,38 ab0±0a7,13±0,40 ab0±0a161,33±0,11а0±0a47,17±4,05 a0±0a5,89±0,41a0±0a30 суток адаптации81,21±0,08а6,09±0,62bcdefgh125,15±7,37bcd37,01±1,42b12,81±0,70abcd4,28±0,10b111,15±0,09а5,27±0,65bcdefgh120,26±5,63efg33,94±1,33b12,67±0,60fghi4,77±0,15bcde121,27±0,10а2,56±0,71abc91,07±6,16bcde26,26±2,10bc10,46±0,67bcdef4,22±0,24bcdef141,09±0,06а4,67±0,84bcdef109,08±9,96def29,65±1,46b12,08±1,06defgh3,97±0,15bc151,19±0,09а5,17±0,84bcdefg105,04±6,87def30,89±1,28b12,25±0,79defghi4,39±0,17bce161,28±0,09а3,53±0,55bd91,09±5,92cde39,30±2,47bcde10,75±0,52cdefh5,07±0,22bcdef45 суток адаптации81,19±0,08а6,89±0,80e161,25±9,99hi52,35±1,83ef17,15±1,02j6,71±0,16hi111,12±0,08а6,24±0,67bcdefgh153,28±7,12ghi45,41±1,80cde16,24±0,64ij6,45±0,19gh121,21±0,10а3,50±0,69abcde129,41±7,54efgh35,37±2,90bcd14,91±0,83ghij5,71±0,36defgh141,11±0,07а6,69±1,06bcdefgh137,76±11,37fgh41,06±2,09 bcd16,00±1,27gij5,56±0,19dfg151,17±0,08а6,59±0,67cefgh126,11±8,00efgh40,80±1,57 bcd14,79±0,67gij5,76±0,16fg161,41±0,11а5,27±0,72bcdefgh107,19±8,15def48,59±3,12de12,39±0,75efgh6,18±0,31fgh60 суток адаптации81,10±0,10а9,10±0,74h206,73±13,68i62,59±2,49fg23,36±1,50k7,28±0,26hij111,10±0,10а8,70±1,05g182,00±9,09hi64,39±2,53g19,27±0,73jk7,16±0,25hij121,00±0,00а6,80±0,33d186,20±8,18hi40,76±2,35bcde20,60±0,86jk5,24±0,25cdefg141,20±0,13а8,67±0,84fgh149,17±7,41fg73,81±2,91g16,00±0,92fghij8,00±0,36ij151,40±0,16а6,80±0,65defgh151,43±13,38fg64,94±2,09g18,86±1,44jk7,29±0,24hij161,40±0,16а5,80±0,53bcdefgh162,57±14,21g66,21±4,05g18,43±1,57jk8,46±0,46j        *здесь и в таблицах 2, 3, 4 согласно тесту Дункана значения с одинаковой буквой различаются несущественно при 5 %-ном уровне значимости.  12 11 14 15 16 8   15 16 14 12 11 8  а)б) 16 15 14 12 11 8  в)Рисунок 2 – Развитие растений лаванды в зависимости от длительности адаптации ex vitro (а) 30 суток; б) 45 суток; в) 60 суток). Примечание: цифрами на рисунке отмечено количество субкультивирований. В ходе адаптации микрорастений к условиям ex vitro происходило накопление вегетативной массы и развитие коревой системы (см. рисунок 1, рисунок 2).У микрорастений, полученных после 8 субкультивирований с 30 по 45 сутки адаптации масса побегов увеличилась в 2,7 раза – это наибольший прирост среди всех пассажей за указанный период. Однако на 60 сутки максимальная в опыте средняя масса микрорастения оказалась после 11 (6,00 г) и 15 субкультивирования (5,78 г), превысив другие пассажи на 24,8…39,6 % (рис. 2а). Схожую тенденцию отмечали и по развитию корневой системы (рис. 2б). Самый активный прирост и вегетативной массы, и корневой системы происходил после 45 суток адаптации ex vitro, когда уже закончен этап адаптации к новым условиям (см. рис. 3а, 3б).За 60 суток акклиматизации растения характеризовались хорошо развитой надземной частью (3,20…6,00 г) и корневой системой (0,619…1,143 г).   а) б)Рисунок 3 – Влияние длительности адаптации ex vitro и количества субкультивирований на массу микрорастений лаванды а) надземной части, б) корневой системы. Известно, что в ходе адаптации микрорастений происходит модификация фотосинтетического апппарата. У растений Decalepis hamiltonii Wight and Arn. установлено линейное увеличение хлорофилла a, b, и каротиноидов после извлечения из культуральных пробирок и акклиматизации со снижением их концентрации в первую неделю акклиматизации [18]. В нашем исследовании также отмечали линейное увеличение хлорофила а – с 4,58 мг/г×10-1 на 14 сутки адаптации ex vitro до 5,74 мг/г×10-1 на 60 сутки, каротиноидов – с 2,80 до 3,33 мг/г×10-1. Содержание хлорофилла b тоже возрастало – с 2,70 мг/г×10-1 на 14 сутки до 3,25 и 3,29 мг/г×10-1  на 60 и 45 сутки соответсвенно. В среднем по пассажам больше всего на длительность культивирования реагировал хлорофилл а и каротиноиды. На 60 сутки, по сравнению с первым учетом, количество хлорофилла а увеличилось на 25 %, b – на 20 %, каротиноидов – на 19 % (рис. 4). Рисунок 4 – Влиняние длительности адаптации ex vitro на содержание фотосинтетических пигментов (в среднем по всем субкультивированиям). По пассажам также наблюдали некоторые изменения в содержании фотосинтетических пигментов в листьях микрорастений лаванды (таблица 3). Так, отмечен достоверный рост содержания хлорофилла а с увеличением количества субкультивирований на 14 сутки адаптации – с 3,99 мг/г×10-1 сырой массы в 8 субкультивировании до 5,17 мг/г×10-1 в 16-ом. В дальнейшем эти изменения нивелировались. Таблица 3 – Влиняние длительности адаптации ex vitro и количества субкультивирований на содержание фотосинтетических пигментов в листьях микрорастений лаванды, мг/г×10-1 сырой массыКоличество субкультивированийХлорофилл аХлорофилл bКаротиноиды14 суток83,99a2,40b2,46a114,65c2,75c2,82b124,89e2,98d3,05c144,58c2,77c2,81b154,21b2,38b2,55a165,17g2,94d3,10с30 суток84,96f3,04d2,95c114,76d2,81c2,80b124,96f3,10d2,95c145,68k3,51f3,35e154,64c2,82c2,85bc165,48i3,38e3,37e45 суток85,41h3,23e3,22d115,12g3,09d3,09c124,57c2,70c2,81b145,74l3,52f3,48e155,60j3,71f3,48e165,86m3,51f3,52e60 суток86,43c4,07g3,95f115,89m3,30e3,41e125,51i3,61f3,37e146,14n2,23a3,56e154,61c2,76c2,80b165,86m3,51d2,88bc При оценке функционального состояния микрорастений в ходе акклиматизации к условиям ex vitro учитывали два основных параметра – индекс жизнеспособности (Fm/F_T) и коэффициент фотосинтетической активности (Kf_n). Динамика изменений этих двух параметров практически идентичены друг другу – коэффициент корреляции составил r=0,97 (p˂0,05). В предыдущих наших исследованиях на микрорастениях лаванды корреляция составляла r=0,60 (p˂0,05) [14]. В другой работе отмечено, что на стадии размножения лаванды in vitro с увеличением количества субкультивирований (с 1 по 4) происходило увеличение индекса жизнеспособности и уменьшение коэффициента фотосинтетической активности [6].В среднем по пассажам индекс жизнеспособности in vitro составил 1,45 и возрастал до 30 суток адаптации до 1,75. На 45 и 60 сутки величина этого показателя снижалась до 1,51 и 1,38 соответственно. В среднем по срокам учета лучшим оказался 8 пассаж – Fm/F_T составил 1,66. Далее по пассажам отмечали его плавное снижение, которое достигло величины 1,47 в 16 пассаже (таблица 4). Те же закономерности отмечены и для коэффициента фотосинтетической активности. Таблица 4 – Влияние количества субкультивирований при клональном микроразмножении и длительности адаптации ex vitro на функциональное состояние микрорастений лавандыПоказатель функциональ-ного состояния растенияКоличество субкультивирований81112141516in vitroFm/F_T1,48±0,031,48±0,031,41±0,031,44±0,031,41±0,041,50±0,03Kf_n0,331±0,0110,332±0,0150,313±0,0130,318±0,0160,293±0,0170,347±0,01314 суток адаптацииFm/F_T1,67±0,051,57±0,051,70±0,051,38±0,041,39±0,041,39±0,03Kf_n0,403±0,0130,378±0,0160,412±0,0190,295±0,0190,289±0,0180,298±0,01530 сутокFm/F_T1,95±0,031,66±0,051,78±0,061,67±0,051,69±0,091,76±0,06Kf_n0,473±0,0080,389±0,0170,426±0,0170,386±0,0200,379±0,0160,415±0,01745 сутокFm/F_T1,61±0,031,58±0,051,57±0,0351,46±0,051,37±0,031,49±0,04Kf_n0,396±0,0100,379±0,0160,369±0,0130,324±0,0210,292±0,0150,329±0,01860 сутокFm/F_T1,61±0,041,51±0,031,41±0,031,30±0,021,25±0,031,22±0,01Kf_n0,366±0,0120,334±0,0100,286±0,0150,236±0,0110,207±0,0170,195±0,009 Во всех пассажах наибольшие величины Fm/F_T и Kf_n были на 30-е сутки адаптации и варьировали в пределах 1,66…1,95 и 0,386…0,473. На 45-е и 60-е сутки происходило некоторое уменьшение этих показателей. Наибольшее снижение наблюдали для растений 14, 15 и 16 пассажей.Выводы. Таким образом, в ходе длительного микроразмножения (8…16 субкультивирований) получены микрорастения, которые хорошо акклиматизировались к условиям ex vitro с частотой адаптации 83…100 %.На 60 сутки адаптации самой высокой длиной побега харакетризовались микрорастения после 8 субкультивирований (206,73 мм), что выше, чем после 14, 15 и 16 пассажей на 21…28 %. По длине дополнительных побегов закономерностей в зависимости от количества субкультивирования не отмечено. По количеству узлов на основном побеге наблюдали тенденцию к их уменьшению с увеличением количества пассажей. С 30 по 45 сутки адаптации наибольшее увеличение массы побегов (в 2,7 раза) выявлено у микрорастений, полученных после 8 субкультивирований. На 60 сутки максимальная в опыте средняя масса микрорастения отмечена после 11 и 15 субкультивирований, превысив другие пассажи на 24,8…39,6 %. На 14 сутки адаптации ex vitro отмечали достоверный рост содержания хлорофилла а с увеличением количества субкультивирований, в дальнейшем эти различия нивелировались. В среднем по пассажам индекс жизнеспособности in vitro составил 1,45 и возрастал до 30 суток адаптации до 1,75. По срокам учета лучшим оказался 8 пассаж – Fm/F_T составил 1,66.Сопоставление всех анализируемых морфометрических и физиологических параметров свидетельствует о хорошей адаптационной способности ex vitro микрорастений лаванды после длительного размножения на протяжении почти двух лет и возможности их успешного микроразмножения, как минимум, в течение 16 субкультивирований. Оптимальный срок адаптации ex vitro составил 45…60 суток, в течение которого растения формировали хорошо развитую надземную часть (до 6,00 г) и корневую систему (до 1,143 г).