доктор сельскохозяйственных наук;
doctor of agricultural sciences;
аспирант сельскохозяйственных наук;
graduate student of agricultural sciences;
Цель данной работы является идентификация видовой принадлежности сырья в мясной и рыбной продукции при помощи полимеразной цепной реакции с наблюдением в реальном времени (ПЦР-РВ). Данный метод способен с высокой точностью обнаружить присутствие заявленного видоспецифичного фрагмента, содержащегося в образце в очень малом количестве. Исследования проведены в 2024 году на базе Татарского филиала Федерального центра охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ»). Для проведения комплексных лабораторных исследований отобрали 18 видов мясной и рыбной продукции, реализуемых в розничных продовольственных магазинах, расположенных в зоне ответственности ФГБУ «ВНИИЗЖ». В результате проведения ПЦР-РВ установлено, что в таких продуктах, как в фрикадельках, ромштексе «Аристократ», котлетах «Афанасьевские», треугольнике с говядиной не было выявлено наличие достаточного количества видоспецифичной ДНК курицы, характерные для мяса курицы, что подтверждает, что вид мяса (кроме птицы) соответствует заявленному. В продукты баветте с индейкой и грибами, индейка в перечном соусе и рисом басмати с базиликом, хинкали из говядины «Халяль», пельмени «Говяжьи», филе горбуши соответствуют заявленному виду мяса и рыбы. Но в вареных сосисках «С говядиной» идентифицировано ДНК свиньи, а в печени трески обнаружено ДНК минтая, что говорит о фальсификации и несоответствия заявленному составу продукта. При исследовании пельменей, холодца, сосисок, вареной колбасы на наличие соевых ингредиентов не выявлено ДНК сои в данных продуктах. Следовательно, одним из наиболее точных методов, способных идентифицировать видовую принадлежность продукции и обнаружить фальсификацию, является полимеразная цепная реакция.
The aim of this work is to identify the species of raw materials in meat and fish products using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). This method is capable of detecting with high accuracy the presence of the declared species-specific fragment contained in the sample in very small quantities. The studies were conducted in 2024 at Tatar branch of Federal Center for Animal Health. (FSBI “VNIIZZh”). For comprehensive laboratory studies, 18 types of meat and fish products sold in retail food stores located in the area of responsibility of FSBI “VNIIZZh” were selected. As a result of RT-PCR, it was found that in such products as meatballs, “Aristokrat” rump steak, “Afanasevskie” cutlets, triangle with beef, the presence of a sufficient amount of species-specific chicken DNA characteristic of chicken meat was not detected, which confirms that the type of meat (except poultry) corresponds to the declared one. The products bavette with turkey and mushrooms, turkey in pepper sauce and basmati rice with basil, khinkali made of Halal beef, dumplings “Beef”, pink salmon fillet correspond to the declared type of meat and fish. However, pig DNA was identified in the boiled sausages “With beef”, and pollock DNA was found in the cod liver, which indicates falsification and discrepancy with the declared composition of the product. When examining dumplings, jellied meat, sausages, boiled sausage for the presence of soy ingredients, soy DNA was not detected in these products. Therefore, one of the most accurate methods capable of identifying the species of products and detecting falsification is the polymerase chain reaction.
В настоящее время на основании достижений молекулярной биологии можно решать проблемы контроля безопасности и качества пищевой продукции, что имеет большое значение на практике. Идентификация мясной, рыбной и растительной продукции по виду сырья можно говорить о качестве и безопасности продуктов питания, к тому же это используется, как средство борьбы с фальсификацией. Мясные продукты являются сложными по составу, так как содержат в себе множество ингредиентов, это в свою очередь ускоряет процесс непреднамеренного или умышленного загрязнения данных продуктов не указанными пищевыми компонентами. К тому же, часть покупателей не употребляют определенные виды мяса в силу культурных и религиозных особенностей [1, 2].В настоящее время имеется спрос на качественную и безопасную продукцию и при этом увеличивается число поставщиков данной продукции. Но в отсутствии точной идентификации продукции возникает риск фальсификации или несоответствия продукции заявленным требованиям [3, 4, 5].При ветеринарно-санитарной экспертизе мясной и рыбной продукции используют органолептические и физико-химические методы анализа, что позволяют определить их качество и безопасность. Но с помощью данных стандартных методов невозможно определить видовую принадлежность сырья. Следовательно, для точной идентификации видовой продукции следует применять полимеразную цепную реакцию [6, 7, 8].Универсальность метода ПЦР позволяет изучать гены продуктивности, которые оказывают влияние на качественные и количественные показатели готовой продукции. Гены молочной и мясной продуктивности оказывают влияние на биохимический состав и качество продукции, которая используется в виде сырья для производства продуктов питания [9, 10].Наиболее перспективным методом контроля мясной продукции является метод ДНК-диагностики – молекулярно-генетический. Преимущество данного метода – это повсеместное присутствие ДНК во всех клетках организма, которые несут практически одинаковую генетическую информацию. Известный и используемый в аккредитованных лабораториях метод точной видовой идентификации мясных ингредиентов животных и птицы в продуктах питания и сырье является ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ, с детекцией продуктов амплификации). Она является наиболее точной, качественной и не совсем дорогой. ПЦР-РВ может высокоточно обнаружить присутствие искомого видоспецифичного фрагмента, который содержится в образце в малых дозах [11, 12, 13]. К тому же данный метод является универсальным, т.е. возможность исследовать как сырье, так и продукты, прошедшие технологическую обработку [14].Метод качественной ПЦР-РВ обладает высокой чувствительностью, при минимальном пределе выявления разных видов мясных составляющих - от 3 геном-эквивалентов для детекции ДНК крупного и мелкого рогатого скота до 50 – для ДНК свиньи, курицы и индейки. В связи с высокой чувствительностью ПЦР-РВ может идентифицировать следы ДНК определенного вида животного, что говорит о загрязнении мясной продукции ингредиентом, который, не представлен в составе продукта [15, 16, 17]. Помимо обнаружения ДНК разных видов животных в мясном сырье и продуктах питания, также следует установить процент присутствующих вспомогательных компонентов к основному мясному сырью, и обнаружить путь проникновения данных добавок в продукт, следовательно, это произошло непреднамеренное загрязнение в процессе технологических операций или специальная замена сырья и как следствие фальсификация готовой продукции [18, 19, 20].Для количественного определения ДНК применяется цифровая капельная ПЦР с прямым подсчетом количества копий целевой ДНК в анализируемой пробе. Он является обновленным методом полимеразной цепной реакцией, которая способна установить абсолютное количество копий ДНК-мишени в образце с чувствительностью до 1 копии ДНК из 100000. Также данный имеет возможность стопроцентного количественного обнаружения числа копий исследуемого фрагмента ДНК или РНК по конечной точке реакции амплификации [21, 22, 23].Поэтому актуальным является идентификация пищевых продуктов и выявление возможной фальсификации или при изготовлении, или при подмене сырья, или при добавлении более дешевого мясного сырья.Цель исследований - идентификация видовой принадлежности сырья в мясной и рыбной продукции при помощи полимеразной цепной реакции с наблюдением в реальном времени (ПЦР-РВ).Материал и методы исследований. Исследования проведены в 2024 году на базе Татарского филиала Федерального центра охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).Для проведения комплексных лабораторных исследований отобрали 18 видов мясной и рыбной продукции, реализуемых в розничных продовольственных магазинах, расположенных в зоне ответственности ФГБУ «ВНИИЗЖ» (табл. 1).Образцы подверглись органолептической оценке. Таблица 1 - Характеристика проб мясной и рыбной продукции№ пробыНаименование продуктаОсновное мясное (рыбное) сырье в продуктеКонтролируемые показатели (наличие / отсутствие)1Фрикадельки для мясного супа (замороженные), Полуфабрикат мясной категории Г. ТУ 10.13.14-030-37676459-2016Говядина, свининаДНК курицы2Ромштекс «Аристократ» (замороженный), Мясные полуфабрикаты рубленые категории Б. ТУ 10.13.14-030-37676459-2016Свинина, говядина, шпик , яичный порошокДНК курицы3Котлеты «Афанасьевские» замороженные, полуфабрикат мясосодержащий, формованный, рубленный, панированный, формированный категории Г. ТУ-9214-003-025673-89-14Говядина, свининаДНК курицы4Треугольник с говядиной РП ш/к 4603774486146ГовядинаДНК курицы5Баветте с индейкой и грибами. РП ш/к 4630238750888Филе грудки индейкиДНК индейки6Индейка в перечном соусе и рисом басмати с базиликом. РП ш/к 4630238750543Филе грудки индейкиДНК индейки7Изделия колбасные вареные сосиски «С говядиной»Говядина, мясо птицыДНК свиньи8Полуфабрикаты в тесте с мясной начинкой замороженные, Хинкали из говядины "Халяль" категории В. ТУ 10.13.14-002-20076927-2020Говядина, жир говяжийДНК свиньи9Мясной полуфабрикат в тесте замороженный, Пельмени "Говяжьи", категории Б. ГОСТ 33394-2015Говядина, конина, жир-сырец говяжийДНК свиньи10Печень трески натуральная. ТУ 9271-0080148646-12Печень трески1. ДНК трески2. ДНК минтая11Печень трески натуральная. ТУ 9271-0080148646-12Печень трески1. ДНК трески2. ДНК минтая12Филе горбуши мороженое, глазированное. ТУ 10.20.13-582-37676459-2017ГорбушаДНК горбуши13Пельмени «Домашние». ГОСТ категории В. ГОСТ 33394-2015Начинки: говядина, свинина, вода питьевая, лук репчатый, соль пищевая, сахар-песок, перец черный молотыйДНК сои14Холодец "Домашний». ТУ 10.13.14-001-0062306901-2015Свинина, говядина, индейка, бульон, желатин, соль пищевая, чеснокДНК сои15Мясные полуфабрикаты в тесте замороженные. Пельмени «Элитные» категории Б. ГОСТ 33394-2015Фарш - говядина, свинина, вода питьевая, лук репчатый, соль поваренная, сахар, перец черный (белый); ДНК сои16Пельмени свино-говяжьи «Домашние». ГОСТ 33394-2015Начинки: говядина, свинина, вода питьевая, лук репчатый, соль пищевая, сахар-песок, перец черный молотыйДНК сои17Сосиски «Молочные» категории Б. ГОСТ 23670-2019Свинина, говядина, вода питьевая, молоко сухое, нитритно-посолочная смесь (соль, фиксатор окраски: Е250), яичный порошок, сахар, комплексная пищевая добавка (стабилизатор: Е450, усилитель вкуса и аромата: Е621, антиокислитель: Е301, пряности: перец черный, перец душистый, кардамон). ДНК сои18Колбаса варёная «Докторская», категории А. ГОСТ 23670-2019Свинина, говядина, вода, яйца куриные, молоко сухое, посолочно-нитритная смесь (соль, фиксатор окраски-нитрит натрия), сахар, орех мускатный, стабилизатор - пирофосфаты, антиокислитель - аскорбиновая кислота.ДНК сои Выделение ДНК из продуктов питания проводили с помощью набора реагентов «ДНК-Сорб-С-М» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора), далее проводили амплификацию методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) используя следующие коммерческие тест-системы производства ООО «Синтол»:- «Gallus gallus / Meleagris gallopavo Ident RT multiplex» для обнаружения видоспецифичной ДНК курицы (Gallus gallus) и индейки (Meleagris gallopavo), результат оценивался по каналу флуоресценции Texas Red, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК курицы и по каналу флуоресценции FAM, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК индейки;- «Sus scrofa Ident RT» для обнаружения видоспецифичной ДНК свиньи (Sus scrofa), результат оценивался по каналу флуоресценции FAM, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК свиньи; - «Gadus macrocephalus / Gadus morhua / Micromesisteus poutassou Ident RT multiplex» для обнаружения трески тихоокеанской (Gadus macrocephalus), трески атлантической (Gadus morhua), путассу (Micromesisteus poutassou), результат оценивался по каналу флуоресценции Texas Red, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК трески тихоокеанской, по каналу флуоресценции FAM, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК трески атлантической;- «Gadus chalcogrammus / Pollachius virens/ Melanogrammus aeglefinus Ident RT multiplex» для обнаружения минтая (Gadus chalcogrammus), сайды (Pollachius virens), пикши (Melanogrammus aeglefinus), результат оценивался по каналу флуоресценции FAM, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК минтая;- «Oncorhynchus gorbuscha / Oncorhynchus keta / Oncorhynchus nerka Ident RT multiplex» для обнаружения лососевых (горбуша, кета, нерка), результат оценивался по каналу флуоресценции FAM, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК горбуши;- «Соя / кукуруза / рапс» для обнаружения и идентификации ДНК сои, кукурузы и рапса, результат оценивался по каналу флуоресценции FAM, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК сои.Учет результатов осуществляли отдельно по наличию кинетической кривой роста сигнала флуоресценции каждого из каналов в зависимости от используемой тест-системы.Критерием регистрации роста сигнала флуоресценции по каналу является величина порогового цикла Ct, которая означает любую величину, не превышающую пороговое значение.Получение и обработка результатов ПЦР-РВ проводились с помощью поверенных приборов для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «Rotor Gene 6000» (Австралия) и модулей измерительных CFX96 в составе термоциклеров для амплификации нуклеиновых кислот C1000 Touch (США).Анализ и обсуждение результатов. В начале исследований была проведена оценка образцов мясной и рыбной продукции (фарш, полуфабрикаты и готовая продукция) по органолептическим показателям согласно действующим нормативно-техническим документам. Результаты исследований представлены в таблице 2. Таблица 2 - Результаты органолептического исследования мясной и рыбной продукции№ образцаФактический результатНормативно-технический документ1Внешний вид равномерной круглой формы, поверхность ровная. Вкус и запах - соответствует продуктам, входящим в состав фрикаделек. Цвет - от светло-серого до серого. Консистенция - мягкая, сочная, однородная.ТУ 10.13.14-030-37676459-20162Внешний вид - кусок говядины овально формы, в панировке сухарей. Вкус и запах - свойственные жареному мясу; вкус в меру соленый. Цвет - корочка от светло-коричневого до коричневого цвета. Консистенция - корочка хрустящая, мясо сочное, мягкое.ТУ 10.13.14-030-37676459-20163Внешний вид - без трещин, форма котлеты овально-приплюснутая с заостренным концом. Вкус и запах - жареного мяса; вкус в меру соленый; аромат лука, специй, без привкуса хлеба, Цвет - поверхность светло-коричневая. Консистенция - сочная, пышная.ТУ-9214-003-025673-89-144Внешний вид – треугольник. Вкус и запах: мясной вкус, запах печеного хлеба и картофеля. Консистенция - мягкая, сочная-5Эластичные, не липкие, прочные, с кусочками мяса индейки и грибами. Вкус и запах - свойственные отварным макаронным изделиям с мясом птицы и грибов.-6Внешний вид - мясо индейки полито соусом. Соус однородный и красного цвет. Вкус и запах соответствует продукту-7Внешний вид - сухая поверхность, нет повреждения оболочки. Консистенция нежная, сочная. На разрезе цвет розовый однородный, равномерно перемешан. Вкус и запах свойственный данному виду продукта с ароматом пряностей-8Внешний вид - мешочек со складочками. Пельмени недеформированные, края хорошо заделаны, фарш не выступает, поверхность сухая. Консистенция плотная. Вкус и запах приятный. Сочная, с ароматом пряностей.ТУ 10.13.14-002-20076927-20209Внешний вид - пельмени полукруглой формы, поверхность сухая, места соединения теста аккуратно защипаны, поверхность гладкая, фарш не выступает, не слипшиеся. Вкус и запах приятный. Цвет оболочки - от светло- кремового до светло-желтого, фарш - серый. Консистенция - оболочка мягкая, плотная, фарша - сочная, мягкая.ГОСТ 33394-201510, 11Печень кусками. Консистенция плотная. Цвет светло коричневая. Вкус и запах приятные, без постороннего привкуса и запаха.ТУ 9271-0080148646-1212Филе целое, чистое. Поверхность ровная. Консистенция плотная. Запах свойственный свежей рыбе, без посторонних запахов.ТУ 10.20.13-582-37676459-201713, 15, 16Пельмени не слипшиеся и недеформированные. Форма круга. Края хорошо заделаны, фарш не выступает. Запах свойственный данному виду продукта. Вкус приятный, свойственный данному виду продуктаГОСТ 33394-201514Поверхность батона чистая сухая, без повреждений. Консистенция упругая. Цвет серый с кусочками мяса. Вкус и запах свойственный данному виду продукта, без посторонних привкуса и запаха, с ароматом чеснока и специй.ТУ 10.13.14-001-0062306901-201517Сосиски удлинённой правильной формы, слегка упругие и плотные. Приятный мясной аромат, молочно-мясной вкус. Цвет светло-розовыйГОСТ 23670-201918Поверхность батона чистая сухая. Консистенция упругая. Цвет фарша на разрезе светло-розовый. Вкус и аромат свойственный данному виду продукцииГОСТ 23670-2019 Исходя из данных таблицы 2 видно, что по органолептическим показателям все восемнадцать образцов мясной и рыбной продукции соответствуют нормативно-техническим документам.Для определения сырьевых компонентов в готовой продукции методом полимеразной цепной реакции были проанализированы мясные и рыбные продукты питания. На рисунке 1 представлены результаты испытаний образцов полуфабрикатов мясных рубленых (№ 1-3) и продукция общественного питания (№ 4) на наличие видоспецифичной ДНК курицы («Gallus gallus»). По каналу флуоресценции Texas Red, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК курицы видно, что контроль выделения (меланж 10%) находится на 26,88 цикле и все, что после данного цикла это, те продукты, как фрикадельки, ромштекс, котлеты, треугольник, не содержат достаточного количества ДНК, характерного для курятины, следовательно, в вышеназванных продуктах нет мяса курицы. Но обнаружено ДНК курицы в следствии того, что в приготовлении данной продукции использовались яйца куриные или жидкие, сухие и замороженные яичные продукты / сырье (белки, желтки, меланж и др.). Рис. 1 Результаты испытаний образцов № 1 (Фрикадельки), № 2 (Ромштекс), № 3 (Котлеты), № 4 (Треугольник), на наличие видоспецифичной ДНК курицы по росту сигнала флюоресценции Таким образом, в результате постановки ПЦР-РВ в мясных продуктах не было обнаружено достаточного количества видоспецифичной ДНК курицы, что подтверждает, что вид мяса (кроме птицы) соответствует заявленному.На рисунке 2 представлены результаты испытаний образцов продукции общественного питания (№ 5 и 6) на наличие видоспецифичной ДНК индейки. Канал, отвечающий за ДНК индейки показал, что в образцах № 5 и 6 обнаружено ДНК индейки, что говорит о наличии в них мяса – индюшатины. Наличие данного вида мяса также свидетельствует о соответствии заявленному составу. Рис. 2 Результаты испытаний образцов № 5 (Баветте с индейкой и грибами) и № 6 (Индейка в перечном соусе и рисом басмати с базиликом) на наличие видоспецифичной ДНК индейки по росту сигнала флюоресценции В результате постановки ПЦР-РВ было установлено присутствие видоспецифичной ДНК свиньи (Sus scrofa) только в сосисках (образец № 7), а в хинкали (образец № 8) и пельменях (образец № 9) не обнаружено свинины (ДНК свиньи), что соответствует заявленному виду мяса (рис. 3). Рис. 3 Результаты испытаний образцов № 7 (Сосиски «С говядиной») и № 8 (Хинкали из говядины «Халяль») и № 9 (Пельмени «Говяжьи») на наличие видоспецифичной ДНК свиньи по росту сигнала флюоресценции На рисунке 4 представлены результаты испытаний образцов печени трески (№ 10 и 11) на наличие видоспецифичной ДНК трески. Каналы, отвечающие за ДНК трески тихоокеанской и атлантической показали, что в образцах № 10 и 11 не обнаружено ДНК трески, а последующие исследования позволили выявить наличие в них ДНК минтая. Рис. 4 Результаты испытаний образцов № 10 и 11 (Печень трески) на наличие видоспецифичной ДНК трески по росту сигнала флюоресценции Таким образом, обнаруженная ДНК рыб семейства тресковых – минтая подтверждает, что видовая принадлежность печени рыб не соответствует заявленной.В результате постановки ПЦР-РВ было выявлено наличие видоспецифичной ДНК горбуши в образце № 12 (филе горбуши), что соответствует заявленному виду рыб семейства лососёвых (рис. 5). Рис. 5 Результаты испытаний образца № 12 (Филе горбуши) на наличие видоспецифичной ДНК горбуши по росту сигнала флюоресценции Из рисунка 6 видно, что по каналу флуоресценции FAM, позволяющий определить специфический фрагмент ДНК сои видно, что все образцы (13-18) это, те продукты, как пельмени, холодец, сосиски, колбаса, не содержат ДНК сои, следовательно, в вышеназванных продуктах нет добавления сои и соевых продуктов (белок сои, твенджан, соевый соус, темпе, тофу, эдамамэ и др.). Рис. 6 Результаты испытаний образца № 13 (Пельмени «Домашние»), № 14 (Холодец «Домашний»), № 15 (Пельмени «Элитные»), № 16 (Пельмени «Домашние»), № 17 (Сосиски «Молочные»), № 18 (Колбаса варёная «Докторская») на наличие видоспецифичной ДНК сои по росту сигнала флюоресценции Результаты ПЦР-РВ идентификации видовой принадлежности мясной и рыбной продукции в обобщенном виде представлены в таблице 3. Таблица 3 - Результаты ПЦР-РВ идентификации видовой принадлежности мясной и рыбной продукцииНаименование образца№ образцаРезультаты ПЦР-РВ по каналуTexas RedFAMHEXДНК курицыДНК трески тихоокеанскойДНК индейкиДНК свиньиДНК минтаяДНК горбушиДНК соиДНК трески атлантическойФрикадельки1В пробе содержится ДНК курицы. Количество ДНК менее ДНК 10% меланжа. Мясо курицы (продукт убоя) отсутствует Ромштекс2 Котлеты3 Треугольник4 Баветте с индейкой и грибами5 18,11 Индейка в перечном соусе и рисом басмати с базиликом6 16,67 Сосиски «С говядиной»7 29,92 Хинкали из говядины «Халяль»8 Не обнаружено Пельмени «Говяжьи»9 Не обнаружено Печень трески10 Не обнаружено 26,27 Не обнаруженоПечень трески11 26,69 Филе горбуши12 15,02 Пельмени «Домашние»13 Не обнаружено Холодец «Домашний»14 Пельмени «Элитные»15 Пельмени «Домашние»16 Сосиски «Молочные»17 Колбаса варёная «Докторская»18