Введение. Почвенная микрофлора представляет собой совокупность различных микроорганизмов, которые находятся в тесной взаимосвязи с растительным миром. Существование микробов в ризосфере во многом зависит от корневых экссудатов растений [1]. Аналогичным образом, эндофиты приносят пользу своему хозяину, синтезируя ценные вторичные метаболиты для своего хозяина и взамен получая пищу и убежище [2]. Одной из причин взаимодействия микроорганизмов с растениями выступает способность микроорганизмов вырабатывать фитогормоны [3]. Фитогормонами, вырабатываемыми микроорганизмами, считаются: ауксин, гиббереллин, цитокинин, этилен и абсцизовая кислота. В дополнение к этим пяти гормонам жасмоновая и салициловая кислоты также документированы как бактериальные гормоны [4]. Индолил-3-уксусная кислота служит наиболее распространенным членом семейства фитогормонов ауксинов [5]. Индолил-3-уксусная кислота в растении участвует в закладке и удлинении корней, а также в других процессах, связанных с дифференциацией и пролиферацией растительной ткани [6]. Также в некоторых исследованиях отмечено, что индолил-3-уксусная кислота управляет точными фенотипическими эффектами в растениях, включая реакцию корней и побегов на свет и гравитацию, дифференциацию сосудистой ткани, апикальное доминирование, инициацию боковых и придаточных корней [7]. Использование бактериальных инокулянтов, способствующих росту растений, в качестве живых микробных биоудобрений служит многообещающей альтернативой химическим удобрениям и пестицидам. Растворение неорганического фосфата и синтез индолил-3-уксусной кислоты выступает одним из основных механизмов стимулирования роста растений бактериями [8].Существует много исследований, где разные ризосферные микроорганизмы использовали как биоагенты для стимуляции роста растений [9, 10, 11]. Результаты этих исследований показывают, что индолил-3-уксусная кислота, выделяемая бактериями, положительно сказывается как на всхожести, так и на росте растений в целом [12]. Положительное влияние оказывает как обработка культуральной бесклеточной жидкостью, так и клеточными препаратами. В связи с этим, выделение из ризосферы и филопланы растений изолятов, продуцирующих фитогормоны актуально. Цель исследований – поиск микроорганизмов-продуцентов фитогормонов для стимуляции роста растений, и составление биологически активного консорциума.Условия, материалы и методы. Работу выполняли в лаборатории молекулярно-генетических и микробиологических методов на базе ФИЦ КазНЦ РАН. Образцы ризосферы и филопланы подсолнечника были получены на разных стадиях развития подсолнечника на опытном поле Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства Федерального исследовательского центра «Казанский научный центр Российской академии наук» в период с июня по сентябрь 2022 г. Все образцы ризосферы и филопланы подсолнечника хранили при температуре +4°С до исследования.Образцы ризосферы и филопланы подсолнечника для исследований собирали в стерильные пробирки типа Falcon на 50 мл. Далее проводили смывы, к испытуемому образцу приливали фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в соотношении 1 г образца: 19 мл буфера, перемешивали с использованием вортекса в течение 1 минуты. Разведенные до 10-6 смывы пересевали на питательную среду Кинга Б (пептон – 10 г/л, глицерин – 10 г/л, K2HPO4 – 1,5 г/л, MgSO4 – 1,5 г/л, агар микробиологический – 20 г/л). Чашки Петри с культурами инкубировали при температуре +28 °С в термостате в течение 24…36 часов.Для определения видовой принадлежности полученных изолятов выделяли геномную ДНК методом фенол-хлороформной экстракции [13]. Полимеразную цепную реакцию амплификации гена 16S рРНК проводили по стандартной методике [14]. Использованы универсальные праймеры 27F (5’-gagtttgatcctggctcag-3’) и 1492R (5’-taccttgttacgactt-3’) [15]. Реакционную смесь для амплификации готовили из расчета на 1 пробу: 10Х Tag-буфер – 5 мкл, dNTP – 1 мкл, праймеры (27F/1492R) – 1 мкл, Таq-полимераза – 1 мкл, ДНК – 1 мкл и mQ – 42 мкл. ПЦР амплификация состояла из 36 циклов – денатурация ДНК при +95°С в течении 20 сек; отжиг при температуре +54 °С в течении 30 сек; синтез при температуре +72 °С в течении 90 сек. Окончательный синтез проводили при температуре +72 °С в течении 5 мин. Полученные ампликоны хранили при температуре -20 °С. Секвенирование проводили по Сэнгеру в компании «Евроген» (Москва). Полученные последовательности секвенирования обрабатывали в программе Clone Manager 9 и сопоставляли с фрагментом гена 16S рРНК, представленным в базе данных NCBI GenBank, с использованием BLASTn (дата обращения: 15.08.2024).Для первичного скрининга биосинтеза индол-3-уксусной кислоты исследуемые изоляты инкубировали на чашке Петри с агаризованной средой LB (триптон – 10 г/л, NaCl – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 1,5 г/л, MgSO4 – 1,5 г/л, агар микробиологический – 20 г/л) с добавлением 0,1% L-триптофана в качестве предшественника индолил-3-уксусной кислоты при температуре 28°С в течении 3 суток. На агаризованную среду с выросшими культурами наносили реактив Сальковского (1 мл 0,5М FeCl3 в 50 мл 35% хлорной кислоты) и оставляли в темном месте в течение 30 минут. Положительным результатом служили розовые круги вокруг колоний. Количественный анализ индол-3-уксусной кислоты выполняли колориметрическим методом. Для оценки количества индол-3-уксусной кислоты изоляты выращивали в среде LB с добавлением 0,1 % L-триптофана, который использовали в качестве предшественника. Культивирование проводили при температуре +28 °С с постоянным встряхиванием (180 об/мин) в течение 72 часов. После завершения инкубации для удаления клеток культуральную жидкость центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 минут. Из полученного супернатанта отбирали 1 мл и смешивали с реактивом Сальковского в соотношении 1:4. Полученную смесь инкубировали в темном месте при комнатной температуре в течение 30 минут. Измерение оптической плотности проводили при длине волны 530 нм. Концентрацию индолил-3-уксусной кислоты оценивали по стандартной кривой в диапазоне 0…1000 мкг/мл. В качестве контроля использовали 1 мл стерильной среды LB, смешанной с реактивом Сальковского [16].Для создания консорциума из микроорганизмов для стимуляции роста растений были отобраны наиболее перспективные изоляты и проводили тест на биосовместимость в трёх разных средах: LB, Кинга Б, PDA (Qingdao Hope Bio-Technology Co., Ltd., Китай). Результаты и обсуждение. По полученным последовательностям гена 16S рРНК большинство выделенных изолятов отнесены к роду Pseudomonas, которые в основном входят в состав группы флюоресцирующих бактерий Pseudomonas fluorescens group, три изолята (АПД43, КПД20 и КПД77) – к классу Actinobacteria и столько же – к семейству Bacilli (КПД8, КПД18 и КПД75).Бактерии комменсалы или симбионты растений часто синтезируют фитогормоны, такие как ауксины, гиббереллины, цитокинины, этилены и абсцизовая кислота. Наиболее распространенным и лучше всего охарактеризованным и физиологически активным ауксином в растениях выступает индолил-3-уксусная кислота, которая повышает как скорость удлинения клеток, так и их деление, и дифференциацию в растениях. Первичный скрининг биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты исследуемых бактериальных изолятов в чашечном тесте на агаризованной среде с реактивом Сальковского, позволил выявить качественную положительную реакцию на все исследуемые изоляты. С использованием колориметрического метода с реактивом Сальковского определили концентрации индолил-3-уксусной кислоты в исследуемых изолятах (табл. 1). Таблица 1 – Концентрация индолил-3-уксусной кислоты в исследуемых изолятахИзолятВидовая принадлежностьКонцентрация индолил-3-уксусной кислоты, мкг/млАПД21Pseudomonas grimontii40,5±0,5АПД23Pseudomonas poae93,0±0,4АПД26Pseudomonas grimontii27,0±1,1АПД28Pseudomonas extremaustralis32,0±2,4АПД43Streptomyces luteogriseus55,2±0,3АПД22Stenotrophomonas rhizophila36,5±2,4КПД8Fictibacillus solisalsi29,0±1,8КПД9Variovorax paradoxus25,5±2,3КПД18Psychrobacillus psychrodurans11,9±2,8КПД20Arthrobacter oryzae66,6±1,5КПД29Pseudomonas poae41,2±2,5КПД38Pseudomonas frederiksbergensis69,6±2,0КПД68Pseudomonas brassicacearum 74,2±2,5КПД70Pseudomonas azotoformans19,6±2,1КПД71Pseudomonas cedrina13,4±0,4КПД75Bacillus aryabhattai56,9±1,6КПД77Arthrobacter oryzae86,1±2,8 Большинство изолятов синтезируют относительно высокие концентрации индолил-3-уксусной кислоты. Наиболее активными продуцентами оказались изоляты АПД23, КПД20, КПД38, КПД68 и КПД77, из которых три относятся к роду Pseudomonas, а два – к Arthrobacter.Род Pseudomonas – хорошо изученная группа микроорганизмов, известных способностью синтезировать индолил-3-уксусную кислоту. В различных исследованиях было показано, что концентрации этого соединения варьируют от 50 мкг/мл до 100 мг/мл [17]. Как сообщают E. Ibrahim, et al. [18], выделенный ими штамм Pseudomonas poae продемонстрировал стимуляцию роста пшеницы и синтезировал 72,5 мкг/мл индолил-3-уксусной кислоты. В то же время изолят АПД23, идентифицированный как Pseudomonas poae, показал более высокий уровень синтеза — 93,00±0,4 мкг/мл. Изоляты КПД38 и КПД68 также продемонстрировали значительные уровни синтеза индолил-3-уксусной кислоты, составившие 69,62±2,0 мкг/мл и 74,25±2,5 мкг/мл соответственно. Эти изоляты были идентифицированы как Pseudomonas frederiksbergensis и Pseudomonas brassicacearum. Согласно исследованиям А. Jiménez-Gómez, et al., Pseudomonasbrassicacearum рассматриваются как перспективные кандидаты для стимуляции роста рапса, что было подтверждено полевыми испытаниями [19]. Кроме того, благодаря их высокой колонизирующей способности и другим положительным свойствам, эти микроорганизмы пользуются высоким спросом при разработке биопрепаратов.Микроорганизмы рода Arthrobacter известны своей устойчивостью к тяжелым металлам и способностью оказывать положительное влияние на загрязненные почвы [20, 21]. Изоляты КПД20 и КПД77 были идентифицированы до вида с использованием последовательности гена 16S рРНК как Arthrobacter oryzae и продемонстрировали высокие уровни синтеза индолил-3-уксусной кислоты, составившие 66,6±1,5 мкг/мл и 86,1±2,8 мкг/мл соответственно. Вид Arthrobacter oryzae был предложен как новый вид только в 2008 г. [22], и его способность синтезировать индолил-3-уксусную кислоту ранее не описывалась. В наших исследованиях впервые отмечена способность микроорганизмов вида Arthrobacter oryzae к синтезу фитогормона индолил-3-уксусной кислоты, что открывает возможности их использования в составе консорциумов из микроорганизмов для разработки биопрепаратов. Для микробных консорциумов с биозащитой, изолят АПД43, который был определен до вида как Streptomyces luteogriseus, будет служить хорошим кандидатом, так как его способность к синтезу индолил-3-уксусной кислоты выше средней среди исследуемых изолятов, точнее – 55,2±0,3 мкг/мл. Кроме того, стрептомицеты известны своими вторичными метаболитами: ферментами, антибиотиками, аминокислотами и др. Поэтому изолят АПД43 может послужить темой для дальнейших исследований.Таким путем по полученным результатам были отобраны пять изолятов и из нихсформирован консорциум. В состав консорциума вошли изоляты, выделенные из растений подсолнечника: Pseudomonas frederiksbergensis (КПД38, штамм, повышающий холодоустойчивость растений и контролирующий стресс растений от засоленных почв), Pseudomonas poae (АПД23, штамм-антагонист фитопатогенов), Streptomyces luteogriseus(АПД43, антагонист фитопатогенов, продуцент антибакткриальных соединений пелиомицина и стрептонола А), Pseudomonas azotoformans (КПД70, подвижный штамм, колонизатор корней растений, смягчает стресс растений при засухе), Fictibacillus solisalsi (КПД8, колонизатор корней, галотолерантный штамм). Эти изоляты совместимы между собой (рис. 1.).Рис. 1 – Совместимость бактериальных штаммов консорциума.Выводы. Изоляты АПД23, КПД20, КПД38, КПД68 и КПД77, выделенные из ризосферы и филопланы подсолнечника, способны продуцировать фитогормоны и могут быть использованы в составе ростостимулирующих биопрепаратов для растений.