The article presents the results of research on natural sourdough lactobacilli adaptation to stress, lined with geographic dependence of resistance of lactic acid bacteria and yeasts, their immunomodulating activity should initiate interest in the development of probiotic products with a variety of pharmacological effects.
lactobacilli, succession processes, biocenosis, mono leaven of strains, bacteriocins, probiotics.
Адаптация лактобактерий природной закваски к стрессу, в частности к воздействию электромагнитного поля, сопряжена с изменением физиологического состояния клеток и экспрессии генов [1, 2]. При этом растущие клетки изменяют биохимическую активность и сукцессионные процессы, обусловленные абиотическими и биотическими факторами, определяя морфологические и физиологические особенности организмов.
Результаты этих исследований показывают неразрывность всех жизненных процессов с условиями среды. Изучая закономерности взаимосвязей эпифитных микроорганизмов, функций и структур растений, формирующих условия местообитания в определенной географической сети, можно решить ряд практических вопросов [3].
Для сельскохозяйственного микробиолога и технолога важны биоценоз и формирование устойчивого и стабильного фитоценоза. Сукцессионные процессы находятся под контролем абиотических и биотических, а в последнее время также и антропогенных факторов. Это приводит к сильному изменению фитоценозов, макро- и микроорганизмов, обитающих на поверхности растений, образованию органического вещества, транспорту энергии по трофическим каналам, отбору видов и т.п. Принцип распределения на Земле ландшафтно-климатических зон, почв, растительности и фауны давно известен, понятен и привычен. В целом, каждый вид растений потребляет определенный набор катионов и анионов, важных для их жизнедеятельности [3].
До сих пор изучают широту распространения природных штаммов молочнокислых бактерий и дрожжей в различных регионах и экологических условиях, удивляясь их чрезвычайной приспособляемости и активности [4, 5]. Большое разнообразие эколого-географических условий Армении, с ее выраженной вертикальной зональностью, способствует развитию, по мнению авторов, уникальных ассоциаций молочнокислых микроорганизмов, использующихся в приготовлении традиционных молочных продуктов. Используют как моноштаммовые закваски, так и ассоциации лактобактерий и дрожжей. Выявлены активные биологические свойства, технологичность штаммов и их перспективы для получения различных биопрепаратов.
Широкий географизм месторасположения, структуры колоний некоторых эпифитных микроорганизмов стал объектом изучения физиологов растений и микробиологов, которые утверждают географию некоторых классов природных веществ, производимых живыми организмами. Широко известно, что масла растений северных и средних широт содержат больше двойных связей, чем жирные масла растений южных широт [6]. В растениях стран умеренного климата и северных широт наблюдается накопление кумаринов, обогащенных кислородом, содержащих в своей молекуле сахарные остатки, сложноэфирные, метокси-, окcи- и окисные группировки [7].
Биохимические процессы в растениях чаще всего направлены на синтез гликозидов, относящихся к одному из рядов стероидного скелета, но имеются виды, которые синтезируют гликозиды двух, трех или даже всех рядов с преобладанием одного из них. Изучение распространения сердечных гликозидов, содержащихся примерно в 10 видах, относящихся к 48 родам, позволяет говорить о закономерном географическом распространении этих веществ по Земле. Существует также географизм распространения природного вещества фурокумарина n-соралена с высокой фотосенсибилизирующей активностью и способностью стимулировать образование пигмента меладинина при облучении УФ-лучами [5].
Как известно, ткани растений покрыты тонкой пленкой – кутикулой, структура которой хорошо изучена, равно как и биосинтез различных полимеров, входящих в состав кутикулы. Листовые смывы со многих растений богаты азотсодержащими соединениями, полифенолами и солями. С поверхности листьев в атмосферу могут поступать тяжелые металлы, поглощенные растением из почвы, а также разнообразные углеводы. Любая поверхность растения может стать местом обитания разнообразных паразитов и симбионтов [4].
Поверхность растения представляет собой динамичную, способную к адаптации оболочку, активно участвующую в транспорте различных соединений как в растение, так и из него. Симбиотрофное существование растений, т.е. обязательное участие микроорганизмов в ряде жизненно важных процессах в растительных организмах, известно более 100 лет назад.
Сегодня мы знаем, что поверхность растения может создавать особую среду, служащую местом обитания различных организмов. Вместе с тем она является важнейшим барьером, отделяющим клетки растения от постоянно меняющейся внешней среды. Поверхность листа образуется в результате взаимодействия окружающей среды и генотипа растения. Тип кутикулы, ее толщина и некоторые другие характеристики поверхности находятся под генетическим контролем.
Поверхность растения воспринимает световую энергию, которая передается другим клеткам. Благодаря этому каждая эпидермальная клетка может служить в качестве своеобразной собирающей свет конденсорной линзы. Вакуоли эпидермальных клеток богаты пигментами: антоцианами и поглощающими ультрафиолетовый свет флавоноидами. Прошедший через эпидермис свет, как правило, затем отражается от лишенного пигментов аэренхимного мезофилла. Недостаточно известно о механизмах восприятия света такой листовой поверхностью. Возможно, начальные фазы этого процесса протекают при участии фитохрома-хромопротеида, который встречается во всех растениях. Микробная жизнь на поверхности растения определяется локальными условиями малых экосистем.
Судьба бактерий на поверхности листа в большей степени определяется влажностью. Входными воротами для бактериальной инфекции служат небольшие повреждения кутикулы. Бактерии быстро размножаются в каплях воды, задержавшихся на листьях. Облучение водяных капель ультрафиолетом не снижает численности бактерий. Видимо, на листе бактерии защищены от облучения УФ складками и выступами кутикулы и индифферентны к действию солнечного света. Возможно, они имеют пигмент, защищающий клетки от облучения.
В любом случае следует заключить, что бактерии являются составной частью естественной флоры растения, а поверхность его (филлосфера) может заселяться разнообразными грибами и бактериями, дрожжами и вирусами. Темпы их роста и размножения достаточно высоки, поэтому часто именно они первыми внедряются в организм хозяина.
Многие бактерии филлоплана содержат каратиноидные пигменты, что можно рассматривать в качестве защитного приспособления к летальному действию света высокой интенсивности и появлению резистентных форм микроорганизмов. По мнению Е.П. Елинова [10], каратиноиды в клеточной мембране и мембранных образованиях могут принимать или не принимать непосредственное участие в защите клетки от фотодинамической гибели действия солнечного света. Каратиноиды гасят синглетное состояние кислорода (О2); они являются как бы протонными насосами, работающими под действием света с образованием АТФ. Одной из функций систем активного переноса является регуляция метаболизма. Мембранные системы переноса, как известно, у микроорганизмов генетически детерминированы, и синтез этих мембран генетически прочно сцеплен с синтезом ферментов.
Такие микроорганизмы объективно приспособлены к природному местообитанию с определенными характеристиками. Экспериментатор, даже если и не знает их особенностей местообитания – а это так обычно и бывает, – вводит в питательную среду организм, который проходит проверку на «прочность» в полном объеме. Судьба объекта всецело определяется его способностью существовать в заданных условиях. Если считать, что свойства популяции соответствуют параметрам местообитания, объект не должен погибнуть [5].
При поедании животными растений микроорганизмы попадают в желудочно-кишечный тракт, где часть их погибает, подвергаясь физико-химическому стрессу, а другая часть, адаптируясь, размножается в пищеварительном тракте и участвует в метаболизме макроорганизма. Наличие в популяции организмов, в разной степени приспособленных к геохимическим факторам среды, и существование в ней организмов с наследственно закрепленными адаптивными реакциями способствует естественному отбору, который в экстремальных условиях может значительно обостриться. Из организмов с наследственно закрепленным признаком устойчивости в ходе эволюционного процесса могут возникнуть новые экологические расы. Особенно ценны бактерии, продуцирующие физиологически активные вещества, обладающие бактерицидным действием по отношению к возбудителям болезней и в целом укрепляющие иммунную систему организма человека.
При самопроизвольном сквашивании молока изменения в микрофлоре протекают как обычно, с участием бактериальных групп, меняющихся количеством бактерий и их соотношением, что было показано в [8]. При сквашивании коровьего молока природной закваской лактобактерий отмечается четкая пространственно-сукцессионная структура ферментированного сгустка [2].
Выделенные штаммы лактобактерий обладают следующими культурально-морфологическими свойствами и признаками.
Streptococcus lactis – грамположительные бактерии, неподвижные, бесспоровые, встречаются парами или короткими цепочками (3–4 кокка). На твердой агаризованной среде Богданова образуют колонии: белые, блестящие, круглые, с ровными краями, слегка приподнятыми (в виде «ободочка»). При глубинном росте в агаре образуют веретенообразные формы.
Lactobacterium acidophilus – грамположительные бактерии, неподвижные, бесспоровые, образуют длинные клетки (цепочки). Интенсивно образуют цепочки при определенном рН и фазе роста, деление клеток приводит к образованию цепочек, расположенных по кругу (см. рисунок 1). Наблюдается формирование инволюционных форм клеток под влиянием длительного хранения кисломолочного продукта при температуре 4 ОС (см. рисунок 1) и интенсивном развитии S.Lactis, метаболизирующем пигмент, который, возможно, активно действует на клеточную стенку ацидофильной палочки.
В последнее время появились болезнетворные микроорганизмы с высокой резистентностью к антибиотикам, что тревожит работников медицины.
В связи с вышеизложенным целью исследований было:
- изучить микроорганизмы природной закваски;
- выделить пигментообразующие лактобактерии, потенциально способные синтезировать бактериоцины.
Материалы и методы
Исследовался кисломолочный продукт, полученный на основе природной закваски в течение длительного срока хранения (10 мес) при разных температурных режимах (4 ОС…26 ОС). Учитывали лактобактерии посевом на твердые питательные среды и определяли сукцессию лактобактерий в течение срока хранения аппликационным методом и методом микроскопии.
Антибиотическую активность штаммов, выделенных из природной закваски, выявляли дискодиффузным методом по образованию зон подавления роста индикаторных бактерий. На агаризованные среды размещали «бумажные диски», пропитанные антибиотиками разных групп, и по диаметру зоны подавления роста тест-организма судили о его степени устойчивости к данному антибиотику.
Протеолитическую активность выявляли на молочном агаре (среда Богданова). Протеолитические ферменты катализируют расщепление белков на поли- и олигопептиды, а интенсивность процесса обнаруживают по зоне просветления среды вокруг колоний или по штриху микроорганизмов. Процесс пигментогенеза лактобактерий устанавливали визуально на поверхности кисломолочного продукта и агаризованной среде. Пигмент из клеток не удалось извлечь и установить его химическую природу.
Обсуждение результатов
Каратиноидные пигменты можно рассматривать в качестве защитного приспособления к летальному действию солнечных лучей. По механизму действия меланинобразующие бактерии «относятся» к антибиотикам, нарушающим обмен нуклеиновых кислот и, как следствие, нарушение синтеза белка. Они являются сильными цитостатиками, что определяет их действие не только на микроорганизмы, но и на животные ткани, в том числе злокачественные образования. Меланины являются природными соединениями, богатыми стабильными свободными радикалами, что указывает о широкой физиологической функции меланопигментов определенных микроорганизмов [9, 10].
Интенсивность образования пигмента у бактерий зависит от ряда условий: доступа кислорода, температуры (около 20–25 ОС), состава питательной среды и др. Нами прослежен меланиногенез на примере лактобактерий природной закваски и выделены штаммы лактококков и дрожжей, образующие пигмент в аэробных условиях [7].
Ранее было показано влияние электромагнитного воздействия на развитие пигмента, некоторые физиологические и морфологические изменения клетки лактобактерий и дрожжей [1, 2]. Установлено изменение биохимической активности, а при увеличении напряженности стресса происходят качественные и количественные преобразования в клетках лактобактерий и дрожжей, что можно взять за основу приема управления генетическими возможностями клетки и изменения программы роста лактобактерий.
Синусоидальные поля колец Гельмгольца, обладая биологической активностью, избирательно изменяли морфологические признаки лактобактерий (Streptococcus lactis) и дрожжей (Saccharomyces sp.), так как эксперимент проводили без экранирования, наблюдалось подавление роста дрожжей и активное развитие лактобактерий. При этом изменялись форма и геометрия клеток дрожжей (они несколько вытягиваются в длину), которые носили достаточно стойкий характер. Это дает возможность предположить о серьезных изменениях свойств маннано-протеидного и глюканового компонентов клеточной стенки, определяющих форму клетки.
Известно, что различные области электромагнитного спектра вызывают разнообразные физиологические изменения, вплоть до мутагенного действия. Особенно это заметно при формировании колоний. Можно предположить, что селективным рычагом в формировании определенных групп эпифитных микроорганизмов служат абиотические факторы местопроизрастания растений. Разнообразие экологических условий определяет географическое распространение лактобактерий и дрожжей, их морфо-биологические особенности и иммунозначимость. Последнее определяет систему требований при селекции и отборе культур молочнокислых бактерий по степени устойчивости к антибиотическим, химиотерапевтическим, химическим препаратам, обладающим широким антимикробным спектром действия.
По нашему мнению, при отборе ценных природных форм лактобактерий, кроме активности протеолиза, кислото- и ароматообразования, необходимо учитывать устойчивость их к лекарственным препаратам. Эти характеристики нужно учитывать также при оценке потенциальных возможностей лакто-дрожжевого сообщества в национальных лечебно-профилактических продуктах питания.
Морфофункциональное изучение развития микроорганизмов природной закваски выявило ряд структурных перестроек в процессе хранения продукта. Своеобразная сукцессия лактобактерий отмечалась уже через 72 часа: преобладали клетки L. acidophilus, Saccharomyces sp. и Str.lactis – были малочисленны, L.lactis был представлен единичными клетками (см. рисунок 1).
Рисунок 1 – Микробный пейзаж закваски
Плотность сгустка довольно высокая, дрожжи практически отсутствуют в верхнем слое, возможно, благодаря активному росту ацидофильной палочки. Однако ниже (слой продукта в 4–5 см) отмечается обильный рост дрожжей, т.е. формируется моновидовая группировка, возможно, за счет степени аэрации в этом горизонте продукта. Органические кислоты как вторичные метаболиты оказывают определенное влияние на расположение (распространение) лактобактерий, их концентрацию и накопление биологически активных веществ. Пространственно-сукцессионное расположение лактобактерий, возможно, определяет качество конечного молочнокислого продукта и физическое состояние сгустка.
Поверхность кисломолочного продукта за 2–2,5 мес покрылась «слизистой тканью», имеет блеск и отличается «микробной чистотой». При микроскопировании обнаружен стабильный дрожжевой ценоз, клетки которых «обрамлены» плотным слоем S.lactis. Практически отсутствует L.acidophilus и L.сasei. При этом не следует забывать, что ацидофильная палочка способна развиваться только при низком поверхностном натяжении, что объясняет ее легкую адаптацию в кишечнике.
Возможно, такая структура ценоза обусловлена накоплением бактерицинов лактококков в зоне аэрации, а пигментация поверхности пленки выполняет протекторную функцию [2].
Можно предположить, что аккумуляция пигментов является адаптивным механизмом клеток, способствующим экономной утилизации избытка макроэргических соединений и обусловливает особенности физиологической регуляции метаболизма запасных соединений. Это происходит не без помощи обилия тех клеток, которые присутствовали вначале, а потом практически вымерли. Их полезное действие продолжается и после гибели. Эндоферменты освобождаются после распада клеточной стенки и вызывают определенное действие на главную составную часть – белки ферментированного продукта.
Нижележащие слои сгустка имеют белый цвет, более уплотнены, ровные по микростроению, т.е. при развитии лактобактерий образуется однородный плотный сгусток с приятным кисломолочным запахом и вкусом.
При разломе поверхности сгустка в капле сыворотки выявлена на фиксированных окрашенных препаратах практически «чистая культура» L.lactis.
Время и условия хранения ферментированного молочного продукта, приготовленного на местной закваске, позволят усовершенствовать технологии получения продуктов для людей с метаболическим синдромом. Выделенные штаммы лактобактерий, продуцирующие антибиотические вещества с широким спектром действия, вполне могут быть с успехом использованы в животноводстве и медицине для профилактики и лечении кишечных заболеваний. Aктивные штаммы лактобактерий природной закваски также могут быть использованы в генетических исследованиях широкого круга микроорганизмов. Их природная активность детерминирует резистентность к антибиотикам.
В данной работе предпринята попытка систематического изложения современных подходов к оценке антибиотикочувствительности лактобактерий природных заквасок. Основной целью исследований антибиотикочувствительности является детекция приобретенной устойчивости к антибактериальным препаратам у природно-чувствительных к ним лактобактерий заквасок разных географических зон. Подтверждение наличия у лактобактерий природной чувствительности и резистентности к антибиотикам является целью практического применения в создании лечебно-профилактического препарата или продукта питания.
Исследование антибиотикочувствительности предполагает последовательное осуществление следующих этапов:
- выделение чистых культур лактобактерий из природного местообитания;
- выбор антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование;
- выбор методов проведения исследования и контроля качества;
- интерпретация результатов исследования и практические рекомендации.
В процессе экспериментов нами были отобраны антибиотикочувствительные микроорганизмы, относящиеся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной устойчивости в естественной среде обитания.
Классификация антибактериальных препаратов основана на их химической структуре и механизмах действия.
Бета-лактамы. Основным элементом химической структуры антибиотиков этой группы является бета-лактамное кольцо (пенициллин, оксациллин, ампициллин). Они обладают общим механизмом действия на микробную клетку, заключающимся в подавлении синтеза пептидогликана путем ингибиции ферментов транс- и карбоксипетидаз и изменений в геноме микроорганизмов, приводящих к аминокислотным заменам. При этом нарушается проницаемость внешней мембраны микробной клетки (обычно утрата пориновых белков). Позднее резко снижается плотность материала клеточной стенки, видимо, полисахаридной природы.
Аминоглюкозиды: стрептомицин, канамицин, неомицин, генатомицин, аминоцин и др., имеют одинаковый механизм действия, заключающийся в связывании малой (30 S) субъединицей бактериальной рибосомы, что приводит к синтезу неполноценных белковых молекул. Антибиотики этой группы, как правило, проявляют активность только в отношении аэробов, анаэробы отличаются природной устойчивостью к аминоглюкозидам.
Макролиды: эритромицин, олеандомицин, ингибируют биосинтез белка. В спектр действия макролидных антибиотиков входят, прежде всего, грамположительные микроорганизмы. Устойчивость бактерий может проявляться либо конститутивно, либо индуцибельно за счет активного выведения (эффлюкс) антибиотиков.
Результаты исследований лактобактерий местных заквасок представлены на рисунке 2.
Рисунок 2 – Диско-диффузный метод определения резистентности штаммов лактобактерий
У дрожжей Saccharomyces sp., при действии электромагнитного излучения, отмечалось резкое уменьшение размеров клеток, падение концентрации цитоплазмы и появление вакуолизированных клеток, т.е. наблюдалось ингибирующие действия. К антибиотикам клетки дрожжей были индифферентны. Ранее мы отметили мутагенное влияние магнитного поля не только на клетки дрожжей, но и на популяцию лактобактерий закваски, изменяя их исходный состав, форму, геометрию клеток и уменьшение размеров. Речь, возможно, идет о серьезных изменениях свойств маннано-протеидного и глюканового компонентов клеточной стенки, определяющих форму клетки [3].
Генетически неоднородная популяция микроорганизмов одного и того же вида формирует колонии нескольких морфологических типов одновременно. Генетические эффекты постоянны и необратимы. Например, лактобактерии, подвергнутые магнитному воздействию, формируют колонии с наличием пигментированных зон за счет, видимо, биохимически измененных клеток. Следовательно, пигментация клеток – результат воздействия электромагнитного поля на биохимические способности лактобактерий, их метаболизм и активность.
При микроскопировании клеточной стенки дрожжей отмечалась рыхлость внеклеточных и внутриклеточных полисахаридов. Структурно-метаболические полисахариды составляют основу клеточной стенки и представляют значительный практический интерес в здравоохранении. Эти полисахариды составляют основу пленки природной закваски.
Таким образом, из представленных выше материалов видно, что в настоящее и будущее время для восстановления нарушенного микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и изготовления или конструирования различных новых функциональных кисломолочных продуктов технологам следует учитывать ряд сложившихся требований к их рецептуре и технологии:
- использование стартовых культур лактобактерий разных географических зон, учитывая географическую зависимость конкретных резистентных бактерий и дрожжей;
- эффективными лечебно-профилактические кисломолочные продукты могут быть при условии хорошей приживаемости лактобактерий в организме реципиента.
В целом результаты наших исследований могут найти практическое применение в медицине, пищевой биотехнологии при производстве функциональных продуктов и здравоохранении, при лактотерапии больных с нарушенным метаболизмом. Установленная географическая зависимость резистентности лактобактерий и дрожжей, их иммуномодулирующая активность должны инициировать интерес к разработке пробиотических препаратов с разнообразными фармакологическими эффектами. Они могут составить серьезную конкуренцию фармацевтическим лечебным препаратам.
1. Sidorenko O.D. Adaptatsiya laktobakteriy k elektromagnitnomu voz-deystviyu [Tekst] / O.D. Sidorenko [i dr.]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. -2013. - № 6. - S. 79, 80.
2. Sidorenko O.D. Molochnokislye bakterii raznykh prirodno-klimaticheskikh zon [Tekst] / O.D. Sidorenko. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. - 2014. - № 12. - S. 63-67.
3. Cidorenko O.D. Mikrobiologiya [Tekst]: uchebnik / O.D. Cidorenko [i dr.]. - M.: INFRA-M, 2013.
4. Botanicheskaya geografiya s osnovami ekologii rasteniy [Tekst]: ucheb. posob. dlya vuzov; pod red. V.G. Khrzhanovskogo i dr. - M.: Agropromizdat, 1986. - 255 s.
5. Dzhuniper B.E. Morfologiya poverkhnosti rasteniy [Tekst] / B.E. Dzhuniper, K.E. Dzheffri; per. s angl. N.P. Matveevoy. - M.: Agroprom-izdat, 1986. - 160 s.
6. Georgievskiy V.P. Biologicheski aktivnye veshchestva lekarstvennykh rasteniy [Tekst] / V.P. Georgievskiy, N.F. Komissarenko, S.E. Dmitruk. - M.: Nauka, 1990. - 335 s.
7. Skala L.Z. Prakticheskie aspekty sovremennoy klinicheskoy mikro-biologii [Tekst] / L.Z. Skala [i dr.]. - M.: Triada, 2004. - 310 s.
8. Sidorenko O.D. Osobennosti rosta assotsiatsiy mikroorganizmov prirodnoy zakvaski [Tekst] / L.Z. Skala. Sb. tr. Mezhd. nauchno-prakt. konferentsii «Intensivnye tekhnologii proizvodstva produktsii zhivot-novodstva». - Penza, 2015. - S. 117-121.
9. Voytkevich A.F. Kurs mikrobiologii [Tekst] / A.F. Voytkevich. - M.: Sel´khozizdat, 1932. - 528 s.
10. Tepper E.Z. Praktikum po mikrobiologii [Tekst] / E.Z. Tepper, V.K. Shil´nikova, G.I. Pereverzeva. - M.: Drofa, 2004. - 282 s.
11. Zenova G.M. Praktikum po biologii pochv [Tekst] / G.M. Zenova. - M.: MGU, 2002. - 119 s.
12. Chernov I.Yu. Drozhzhi v prirode [Tekst] / I.Yu. Chernov. - M.: KMK, 2003. - 336 s.
