Dubna, Moscow, Russian Federation
Nowadays more and more deaths are caused by cardiovascular disease. And I think it is very important to develop new drugs that would help to avoid such consequences and prevent the deterioration of patients, leading to their recovery. The present work is devoted to the study of functions of mitochondrial nitric oxide synthase (mtNOS) and its role in diseases of the cardiovascular system. The completely new therapeutically-potential target for new drugs to prevent heart disease, its discovery caused a lot of doubt and wonder, structurally recognized as a form of one of the known synthases, that is known as neuronal NO synthase, it is still raises many questions between scientists and professors who are engaged in its research. Sometimes it is very dangerous, leading to the synthesis of reactive oxygen species and cell death, and sometimes as a cell saver, protecting cells from hypoxia, evenly distributes the oxygen supply for the cells, and prevents from the excessive contraction in muscular dystrophy, and also protects the death of the cell, functionally capable to prevent the opening of the mitochondrial permeability pores transient. The ability to manage its activity would be a starting point for the creation of a potentially new and selective agents for the treatment of cardiovascular diseases such as coronary heart disease, heart failure, right ventricular hypertrophy in pulmonary hypertension. Its location that is called "heart in heart" makes us to believe that its work must also be well controlled as well as we taking care of the functioning of the human heart, and the increasing of new knowledges of its structure and properties will significantly help us in it.
mitochondrial nitric oxide synthase, cardiovascular disease, ischemia, mitochondrial permeability transition pore
В настоящее время одними из наиболее опасных и часто встречающихся заболеваний являются сердечно-сосудистые патологии. И, к сожалению, они занимают первые места в причинах смертности населения. В связи с этим каждый год проводят многочисленные исследования причин их возникновения, а опираясь на них, ученые разрабатывают всё новые и новые лекарственные препараты, которые могли бы помочь людям, страдающим заболеваниями сердечно-сосудистой системы.
Наиболее перспективными средствами для лечения таких пациентов являются лекарства с как можно большей избирательной способностью к тем процессам и молекулярным соединениям, которые и вызывают патологический процесс. И одними из подобных препаратов, скорее всего, станут лекарственные вещества, влияющие на активность митохондриальной NO синтазы. Поэтому я считаю важным как можно больше узнать о структуре и особенностях функционирования данного фермента.
Открытие и доказательства
Долгое время в медицине существовало понятие только о трех синтазах оксида азота: эндотелиальной, индуцибельной и нейрональной. В настоящее время открыта еще одна синтаза – митохондриальная [1-7]. С момента её открытия в 1995 г. появилось множество точек зрения по поводу существования специфической изоформы NOS в митохондриях (именуемые mtNOS). Данный вопрос во многом зависел от возможности выделения чистых фракций митохондрий, не содержащих посторонних включений. Если же исследовать непосредственно по содержанию и продукции NO в изолированных митохондриях, то не всегда будет точно известно, были ли они синтезированы внутри митохондрии или диффундировали из внутриклеточного пространства. Простой ответ на данный вопрос можно получить посредством регулирования фермента mtNOS с помощью внутримитохондриального кальция, pH или другими механизмами.
Долгое время шел спор о том, какая именно из изоформNOS локализуется в митохондриях и мнения об активации и самой деятельности mtNOS. Большинство точек зрения склонялись к тому, что mtNOS может быть либо eNOS, либо nNOS, так как mtNOS также как и вышеуказанные регулируется кальцием. Большая часть сомнений относительно принадлежности mtNOS происходит еще и из-за отсутствия селективности анти-NOS антител. Так, используя антитела, можно предположить, что mtNOS может быть каждым из известных NOSб, либо ни одним из них.
Наиболее верные доводы были получены из экспериментов Kanai и других ученых. В выделенных из сердца мышей митохондриях использовался порфириновый микросенсор. Стимуляция продуцирования NO осуществлялась с помощью Ca и ингибировалась блокированием электрогенного поглощения митохондрией Ca или антагонистами NOS. В результате экспериментов, mtNOS была идентифицирована как изоформа нейрональной синтазы оксида азота (nNOS), так как синтез NO прекращался в митохондриях, где отсутствовала nNOS, но отсутствие эндотелиальной или индуцибельной синтаз не мешало синтезу NO. Важно отметить, что синтез NO зависел от митохондриального поглощения кальция и был заблокирован рутением красным, что убедительно свидетельствовало о том, что синтез NO происходил в митохондрии. Выделенный из печени крысы mtNOS с помощью анализов MALDI-TOF был идентифицирован как nNOSα. Также он был обнаружен в сердце и скелетных мышцах, но внутриклеточная локализация его официально не доказана. Однако идентичность этих ферментов однозначно не установлена, но кажется вероятным, что сердечная mtNOS является изоформой nNOS.
Строение mtNOS
Митохондриальная синтаза NO, исходя из исследований, является изоформой альфа нейрональной NOS. И в отличие от nNOS имеет две особые посттрансляционные модификации: ацилирование – найденное у eNOS, а также фосфорилирование в С-конце.
Роль mtNOS в норме
Существует несколько источников NO, которые могут влиять на метаболизм митохондрий в кардиомиоцитах. Исследования выявили синтез 0,7-7,7 нмоль NO/мин/мг белка в изолированных митохондриях миокарда, сравнили их деятельность аналогичную митохондриям других органов, приходя к выводу, что mtNOS способствует около 56% общего клеточного производства NO.
Так как все другие изоформы NOS синтезируются не митохондриальной, но ядерной ДНК, mtNOS, как считают ученые, синтезируется в цитозоле и перемещается в митохондрии, хотя механизм транслокации до сих пор остается неизвестным. Исходя из исследований, митохондриальная синтаза оксида азота обладает функциями, адаптированными к потребностям клеток. Так, например, активность mtNOS в скелетных мышцах регулируется под действием щитовидной железы, а те, которые находятся в головном мозге и сердце функционируют под действием гипоксии. С одной стороны, гипоксия должна замедлять синтез NO, так как при нем используется кислород и L-аргинин. Однако есть сведения о повышении активности mtNOS при гипоксии. Однако все зависит от степени гипоксии. При умеренной гипоксии возникает компенсаторно-приспособительная активация синтеза NO.
Важность mtNOS в митохондриях сердца высока, учитывая важнейшую роль этой органеллы в производстве энергии в таком органе с высоко активным метаболизмом. Считается, что mtNOS является потенциалзависимым ферментом, у которого генерация NO регулируется потенциалом митохондриальной мембраны в соответствии с потребностями в энергии клетки, а NO в свою очередь регулирует активность цепи переноса электронов. В 2003 г. ученые Virginia Haynes, Joseph Solien и другие сообщили, что NO при малых концентрациях действует как конкурентный ингибитор цитохромоксидазы в очищенных и изолированных митохондриях.
На основании первоначальных результатов было предположено, что митохондриальный синтез NO позволяет распределять транспорт кислорода между клетками, находящимися на различных расстояниях от капилляров. Клетки, находящиеся ближе всего к кровеносному руслу, будут иметь наибольшую концентрацию L-аргинина и кислорода, которые стимулируют mtNOS и синтез NO. NO, взаимодействующий с цитохромоксидазой, в свою очередь, будет уменьшать потребление кислорода кислородсодержащими клетками, позволяя O2 диффундировать вглубь ткани, что может минимизировать гипоксию.
Однако высокий уровень NO может привести к губительным последствиям, среди которых, ингибирование дыхательной цепи, увеличение уровня АФК и нитрование митохондриальных белков.
Несмотря на свой положительный, эффект NO при его избытке или полном отсутствии будет нарушаться градиент распределения кислорода. Таким образом, митохондрии, находящиеся далеко от капилляров будут находиться в состоянии аноксии (градиент не достаточно распределен в дальних от капилляров клетках) или псевдоаноксии (кислород есть, но использоваться не может из-за блокады дыхательной цепи). Это приведет к разобщению окислительного фосфорилирования и гиперполяризации митохондриальной мембраны. Последствием этого эффекта будет ингибирование синтеза АТФ и переключение клеток на гликолиз для поддержания энергетических потребностей ткани. Таким образом, увеличение содержания mtNOS в клетках сердца коррелирует с возрастанием мембранного потенциала и увеличением потребления глюкозы.
Роль mtNOS при патологии
Кроме своей роли в производстве энергии, митохондрии также тесно связаны с процессами, приводящими к гибели клеток. Так, в сердце явления апоптоза и некроза четко свидетельствуют о наступившем инфаркте миокарда или об эпизоде ишемии / реперфузии. Например, эпизод ишемии / реперфузии сопровождается взрывом активных форм кислорода (АФК). В этом явлении митохондрия также играет важную роль, участвуя в производстве всех его видов. Ученые из Медицинского центра Университета штата Огайо исследовали механизм смерти клеток сердца при восстановлении кровотока при помощи специализированной техники. В экспериментах митохондрии клеток сердца были подвержены ишемии и реперфузии – закупорки и перезапуска кровотока. Результаты были опубликованы в октябрьском журнале Молекулярной и Клеточной Кардиологии. В лаборатории Ghafourifar разработали методику, позволяющую исследователям наблюдать за изолированными митохондриями во время этого процесса в режиме реального времени. Используя химические датчики и новый метод, называемый спектрофотофлюорометрия, они увидели, что после эпизода ишемии / реперфузии в митохондриях произошло повышение уровня кальция. Этот избыток кальция привел к активности фермента mtNOS, который начал синтезировать токсичные уровни свободных радикалов оксида азота, с которыми митохондрия уже не может справиться. А избыток оксида азота приводил к синтезу митохондриального белка, который посылал сигнал смерти клетки.
С другой стороны, также существует и защитный эффект NO при болезнях сердца. Так, например, проводилось исследование дистрофин-дефицитных (mdx) мышей, у которых повышенный внутриклеточный Ca приводил к активированию mtNOS, а, следовательно, и к повышению синтеза NO, снижению окислительного фосфорилирования, а также снижению продукции АТФ. Однако ингибирование mtNOS приводило к повышению сократимости в mdx. Данное исследование привело к мысли о том, что mtNOS способна защищать клетки от пересокращения.
В 2009 г. в журнале физиологии Дедкова и Блаттер исследовали роль митохондрий в производстве NO и его отношение к продукции АФК и проницаемости митохондрий. Их результаты подтвердили наблюдения Kanai и др. (2001), что синтез NOCa зависим и блокада его поступления в клетку отменяет синтез NO. Интересно также, что для активации mtNOS необходим подъем уровня цитозольного кальция выше 1 мкм (такая концентрация наблюдается в течение адренергической стимуляции или при реперфузии), а также кальмодулин. Поскольку митохондрии были проницаемы, также для синтеза митохондриальных NO необходимо добавлять и L-аргинин.
Важно отметить, что та часть цикла мочевины, в котором синтезируется и используется L-аргинин, происходит в митохондриях. Аргиназа II – фермент, который катаболизирует аргинин, находится в митохондриях и конкурирует с mtNOS за субстрат. При отсутствии аргинина синтез АФК наблюдался при подъеме уровня кальция. Добавление аргинина почти отменяло производство АФК, когда ингибирование аргиназы снижало производство АФК на 50% (без добавления аргинина).
Исследованию также подверглась связь NO с открытием митохондриальной поры с транзиторной проницаемостью (MPTP), которая открывается в ответ на высокий уровень кальция, низкий уровень АТФ и АФК. Открытие этого канала приводит к резкой деполяризации митохондрий с последующим истощением АТФ и гибелью клеток. Открытие MPTP было предотвращено, когда продукция АФК была нейтрализована с помощью АФК-миметика супероксиддисмутазы или когда были добавлены L-аргинин или тетрагидробиоптерин (BH4), кофакторы для mtNOS. Таким образом, поддержание физиологических концентраций L-аргинина и BH4 имеет кардиопротекторное действие, что особенно важно для пациентов с хронической сердечной недостаточностью и при операциях на сердце. Интересно, что добавление L-аргинина почти отменяло открытие пор с эффектом, аналогичным циклоспорину А, ингибитору MPTP. Эти результаты подтверждают тот факт, что mtNOS блокирует открытие MPTP, когда уровень внутриклеточного кальция высокий. Пока не ясно, опосредован этот эффект непосредственно через NO (например, S-нитрозилирование активных тиолов) или благодаря нейтрализации АФК. Также существует предположение, что закрытие митохондриальной поры с транзиторной проницаемостью происходит от ингибирования цитохромоксидазы под воздействием NO. Напротив, в присутствии окислительного стресса (например, при реперфузии или в течение застойной сердечной недостаточности) или при отсутствии достаточного L-аргинина, увеличение цитозольного кальция инициирует нитрозолирование тиоловых групп митохондриальных белков, угнетение синтеза АТФ и открытие митохондриальной поры с транзиторной проницаемостью и неизбежно приводит к гибели клеток.
Нельзя однозначно сказать, что митохондриальный NO ограничивается цитотоксическим или только защитным эффектом, он определяется соотношением стрессовых факторов и факторов выживания клетки, что и направляет NO по тому или иному пути.
Значение для фармакологии
Фармакологическая регуляция mtNOS имеет большое значение и предполагает разработку лекарственных средств, обладающих большой избирательностью действия, которые можно было бы использовать, например, при эпизодах ишемии / реперфузии миокарда. В экспериментах показана высокая активность mtNOS при ишемической болезни сердца (особенно в случаях тяжелой гипоксии) и гипертрофии правого желудочка при индуцированной гипоксией легочной гипертензией.
Исходя из изученных данных ученые предполагают, что, возможно, переход на гликолитический фенотип с гиперполяризацией приводит к состоянию резистентности к апоптозу наподобие состояния клеток во время рака, на длительное время адаптируя клетку к стрессу от гипоксии и к увеличенной постнагрузке, но всё это ценой неоптимального производства энергии и высокой сократимости. Исследования показали, что Дихлорацетат натрия (DCA) и Силденафил улучшают сократимость RVH, что подтверждает тот факт, что также хорошо могли бы сработать и ингибиторы mtNOS в RVH. Как уже упоминалось в опытах Kanai и других ученых, ингибирование mtNOS у мышей с кардиомиопатией приводило к увеличению сократительной способности сердца мышки. Zaobornyj и другие ученые обнаружили, что Силденафил снижает активность mtNOS в сердцах крыс, подтверждая тот факт, что Силденафил увеличивает сократимость RVH. Однако эти выводы сложно подтвердить, так как уже ранее говорилось о том, что силденафил снижал постнагрузку RV, что по своей сути и могло способствовать вторичному снижению в RVH. Другими словами, Силденафил, который в настоящее время используется для лечения легочной артериальной гипертензии, может уменьшить действие mtNOS на миокард и вместе с тем уменьшить постнагрузку.
Несмотря на то что mtNOS находится в сердце при нормальных условиях в очень малом количестве, при патологии его регуляция могла бы стать хорошей терапевтической мишенью. Тот факт, что содержание mtNOS в нормальном сердце мало, не должен мешать активному исследованию его роли при заболеваниях миокарда. Наоборот, делая всё больше дополнительных исследований, и подтвердив уже сделанные теории, ученые могли бы создать лекарство, которое помогло бы спасти многие жизни.
1. Sean M. Davidson, Michael R. Duchen (2006)Effects of NO on mitochondrial function in cardiomyocytes: Pathophysiological relevance. European Society of Cardiology.
2. Daniel R Gonzalez, Adriana V Treuer, and Raul A Dulce. Neuronal nitric oxide synthase in heart mitochondria: a matter of life or death. Interdisciplinary Stem Cell Institute, Miller School of Medicine, University of Miami, Miami, FL, USA. J Physiol. 2009 Jun 15; 587(Pt 12): 2719-2720.
3. Biochim Biophys Acta. 2010 Jan; 1802(1): 92-99.Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia. National Institutes of Health grants P50 NS014543, RO1 NS025372, RO1 NS036147, and RO1 NS038653
4. Division of Vascular Diseases & Surgery/ Mitochondria Send Death Signal to Cardiac Cells, Study Shows/ The Ohio State University.
5. Journal of Aging Research Volume 2012 (2012), Article ID 192503, 9 pages. Is There a Link between Mitochondrial Reserve Respiratory Capacity and Aging? Claus Desler, Thomas Lau Hansen, Jane Bruun Frederiksen, Maiken Lise Marcker, Keshav K. Singh, and Lene Juel Rasmussen/ Received 1 February 2012; Accepted 11 April 2012.
6. IUBMB Life, 55(10-11): 599-603, October-November 2003/ Mitochondrial Nitric-oxide Synthase: Role in Pathophysiology. Virginia Haynes, Sarah L. Elfering, Rachel J. Squires, Nathaniel Traaseth, Joseph Solien, Adam Ettl and Cecilia Giulivi.
7. Jayan Nagendran and Evangelos D. Michelakis. Pulmonary Hypertension Program, University of Alberta, Edmonton, Canada / Mitochondrial NOS is upregulated in the hypoxic heart: implications for the function of the hypertrophied right ventricle/ Am J Physiol Heart Circ Physiol 296: H1723-H1726, 2009.
