Abstract (English):
According to the authors three fundamental Laws of Nature : 1. The Law of exponential growth of microorganisms; 2. The Law ofdirect proportionality which is unknown now to the most of microbiologists; 3. The Law of exponential reduction in the course of time of survived passive (latent) microorganisms in biological samples (e.g. in dry bacterial concentrates) under their permanentstorage conditions making cell growth impossible are the basis of general microbiology. All microbiologists recognize only the Firstlaw out of the three Laws listed. The remaining two Laws are not recognized officially so far. This work substantiates the necessity to recognize all three Laws of Nature as only the three make the fundamental base of general microbiology. Living cells of microorgan-ism growing culture comprise active (growing) and passive (latent) cells: (X gen.)o = (Xact.)o + (X pas.)o. Only active cells are growing in the exponentially growing culture. Passive cells are not growing and therefore the known equation of exponential growth of all living cells of the culture (Xgen.)t = (Xgen.)o · (Xpas.) · e μt is not really observed: (Xgen)t = (Xact.)o · e μt + (Xpas.)o # [(Xact.)o] · e μt. A new equation of exponential growth of all living cells of the culture considering a continuous passivation of active cells has been derived: (Xgen.)t = (Xgen.)o · e αμ · t, where μ = const., αt means the part of active cells in the cultural media. In the exponentially growing culture the value αt is gradually reducing with time and so the natural growth of the culture is not and can’t be strictly exponential. The ne- cessity to introduce the proposed clarifications and changes in the Law of exponential growth of microorganisms is stipulated by the earlier unknown phenomenon of passivation (formation of latent forms) of active cells of exponentially growing culture of microor- ganisms during the whole period of its growth. The Law of direct proportionality - the basic law of microorganisms’ vital activity - has been considered in brief. According to the Law of direct proportionality the increase of microorganism concentration in the cul- tural medium is directly proportional to a simultaneous increase of metabolite ∆Mt concentration and a simultaneous decrease of substrate (-∆St) concentration in it as well as a simultaneous increase of titratable acidity of the cultural medium ∆At (under lacticacid bacteria cultivation): ∆Xt[CFU/ml] = Kc · (-∆St)[g/l] = KM· · ∆At[ oT]. (Formulated by Maryin V.A. in 2002. Experimentallysubstantiated by him in 2003). Newly formulated and substantiated in detail has been unrecognized now by microbiologists the Third Fundamental Law of general microbiology mentioned above: (Xpas.)t = (Xpas.)o · e - t. Microbiologists’ attention is attracted to the discovery of the new phase of microorganisms’ growth - the phase of linear growth at All-Russian Dairy Research Institute, (MaryinV.A. 2002).

Keywords:
General microbiology, three functional Laws, new phase of linear growth

Введение Многовековое здание механики основано на трёх фундаментальных Законах Исаака Ньютона, которые известны каждому школьнику. Достраиваемое сейчас здание общей микробиологии также основа- но, по нашему мнению, на трёх фундаментальных Законах Природы, которые указаны ниже. 1. Закон экспоненциального роста микроор- ганизмов: (Хобщ)t = (Хобщ)о · eµt . (Открыт A. Phelps в 1936 г.) Фундаментальный Закон экспоненциаль- ного роста микроорганизмов признан микробиоло- гами со дня открытия, а два других официально не признанных фундаментальных Закона Природы, перечисленные ниже, в настоящее время Законами Природы не считаются. 2. Закон прямой пропорциональности: ∆Хt[КОЕ/мл] = KC·(-∆St)[г/л] = KM·∆Mt[г/л] = = КА·∆Аt[0Т]. (Сформулирован В.А. Марьиным в 2002 г. Теоретически и экспериментально обоснован им в 2003 г. Публикации Автора прошли незамеченны- ми, поэтому большинству микробиологов этот За- кон сейчас практически неизвестен.) Закон прямой пропорциональности - это основной закон жизне- деятельности микроорганизмов, согласно которому прирост концентрации растущих клеток в культуральной среде (∆Хt) прямо пропорционален одно- временному приросту в той же среде концентрации продуцируемого растущими клетками метаболита (∆Mt), а также одновременной убыли концентра- ции потреблённых микроорганизмами компонен- тов субстрата (-∆St) и одновременному приросту титруемой кислотности (∆Аt) культуральной среды. Чтобы облегчить микробиологам изучение, оценку и критический анализ различных аспектов Второго фундаментального Закона общей микро- биологии - Закона прямой пропорциональности, мы опубликовали в сборнике научных трудов ВНИМИ (2012 г.) подробное теоретическое и экс- периментальное обоснование нового Закона [1]. Рекомендуем ознакомиться с ним всем биологам и микробиологам. 3. Закон экспоненциального снижения со временем концентрации выживших пассивных клеток микроорганизмов (Хпас) в биологической пробе (бактериальном концентрате) при хране- нии её в неизменных условиях, исключающих рост клеток: (Хпас)t = (Хпас)о · e- λt . Официально не признан биологами и окончательно не сформули- рован. Многие микробиологи считают его не Зако- ном Природы, а частной закономерностью процес- са отмирания клеток микроорганизмов по экспоненциальному закону. Они ошибочно отождеств- ляют два разных проявления единого процесса вы- живания и отмирания пассивных клеток. Перед детальным рассмотрением ниже «непри- знанного» Третьего фундаментального Закона об- щей микробиологии необходимо сразу же отметить различие между понятиями выживания и отмирания клеток, чтобы устранить путаницу, которую допус- кают даже опытные и авторитетные исследователи: «Если относительное число выживших клеток откладывать в логарифмическом масштабе, а время в линейном, то часто получается прямая линия (рис. 38, I); это означает, что процесс гибели мик- роорганизмов идёт по экспоненциальному закону. Кривые выживания столь часто имеют экспоненци- альный характер, что некоторые авторы пришли к мысли о существовании некоего общего процесса, лежащего в основе всех стерилизующих средств [528]. Однако нет сомнения, что процесс гибели далеко не всегда подчиняется экспоненциальной зависимости [286]».(Ссылки внутри цитаты остав- лены нами без изменений) [2]. Исследователи верно отметили, что «кривые выживания (клеток) имеют экспоненциальный ха- рактер», и отсюда сделали ошибочный вывод, что «процесс гибели микроорганизмов идёт по экспо- ненциальному закону». Однако в действительности процесс гибели микроорганизмов не идёт по экспоненциальному закону. Выживание клеток и гибель (отмирание) клеток - это два разных проявления единого процесса вы- живания и отмирания клеток. Образно говоря, это разные стороны одной монеты. Бегло отметим, что концентрация в биологической пробе выживших при хранении клеток экспоненциально снижается со временем, а концентрация погибших (мёртвых) клеток одновременно возрастает, причём не по экс- поненциальному закону. Пассивные клетки «по экспоненциальному закону» выживают (а не отми- рают)! В конце ХХ века из-за отмеченной путаницы между понятиями отмирания и выживания клеток Третий фундаментальный Закон общей микробио- логии после многолетнего обсуждения так и не был признан биологами. Тем не менее, и сейчас микро- биологи успешно используют в своих исследова- ниях «частные закономерности» официально не существующего Третьего Закона микробиологии. Это означает, что непризнанный Третий Закон по- прежнему жив и, по мнению авторов, безусловно, будет жить! Таким образом, только один из трёх фундамен- тальных Законов Природы, которые все вместе, по нашему мнению, являются фундаментальной осно- вой общей микробиологии, официально признан микробиологами и введён в научный оборот. Вот уже почти 80 лет здание общей микробиологии 116 ISSN 2074-9414. Food Processing: Techniques and Technology. 2015. Vol. 37. № 2 стоит, образно говоря, на одной ноге. Давно пора микробиологам поставить общую микробиологию на более основательный, устойчивый и надёжный фундамент! Цель данной работы - привлечь внимание мик- робиологов во всём мире к нерешённым фундамен- тальным проблемам общей микробиологии, о кото- рых многие даже не подозревают. За последние 15 лет в результате исследований, проведенных нами во ВНИМИ, предложены новые решения основных нерешённых фундаментальных проблем общей микробиологии. Однако найденные решения, опуб- ликованные в трудах ВНИМИ и других изданиях, до сих пор остаются неизвестными и непризнан- ными. Поэтому отмеченные выше проблемы по- прежнему остаются нерешёнными для подавляю- щего большинства микробиологов. В первую очередь сообществу микробиологов необходимо вернуться к детальному рассмотрению всех трёх перечисленных выше Законов Природы, включая и Закон экспоненциального роста. В дан- ной работе нами впервые рассмотрена необходи- мость уточнения общепризнанной формулировки Закона экспоненциального роста микроорганизмов и сформулировано изменённое уравнение Закона, учитывающее непрерывную пассивацию (образо- вание покоящихся форм) экспоненциально расту- щих клеток культуры. Микробиологам необходимо впервые рассмот- реть и изучить открытый в ХХI веке фундамен- тальный Закон прямой пропорциональности (Вто- рой фундаментальный Закон микробиологии), ко- торый является основным законом роста и жизне- деятельности микроорганизмов (В.А. Марьин, 2002 г.) [3, 4]. Микробиологам следует также в очередной раз вернуться к детальному рассмотрению непризнан- ного Третьего фундаментального Закона общей микробиологии, который в конце прошлого века неоднократно анализировали и обсуждали, но так и не решились его официально признать. По нашему мнению, необходимо заново изучить результаты экспериментальных и теоретических исследований, включая те, которые проанализированы в нашей работе, и после затянувшегося полувекового раз- думья принять обоснованное верное решение, т.е. официально признать Третий закон фундаменталь- ным Законом Природы. Наконец, сообществу микробиологов необхо- димо впервые рассмотреть и официально признать открытие новой фазы роста микроорганизмов - фазы линейного роста (В.А. Марьин, 2002 г.) [5, 6]. Следует также внести во все новые учебники по общей микробиологии предложенные и обоснован- ные ранее две дополнительные принципиально но- вые схемы последовательности фаз роста периоди- ческой культуры микроорганизмов. Каждая из этих двух новых схем включает новую фазу линейного роста культуры [7, 8]. Тем самым будет устранена систематическая ошибка всех современных учеб- ников и ранее опубликованных монографий по об- щей микробиологии, в которых единственным ре- жимом роста периодической культуры микроорганизмов «по старинке» ошибочно принято считать режим экспоненциального роста культуры. Объект и методы исследования В данной статье проанализированы и подытожены результаты теоретических и экспериментальных исследований во ВНИМИ фундаментальных про- блем Общей микробиологии за последние 15 лет. Кроме того, детально рассмотрены опублико- ванные результаты исследований российских и за- рубежных учёных, связанных с изучением пробле- мы выживания клеток микроорганизмов в различ- ных биологических пробах, например, в сухих, за- мороженных или жидких охлаждённых бактери- альных концентратах в процессе их хранения. Предложено дополнительное обоснование фунда- ментальности официально пока не признанного Третьего фундаментального Закона общей микро- биологии - Закона экспоненциального снижения со временем концентрации выживших пассивных (по- коящихся) клеток в биологической пробе при хра- нении её в неизменных условиях, исключающих рост клеток. Проанализированы конкретные при- меры использования Третьего закона в практике микробиологических исследований. Результаты и их обсуждение Комплексный единый процесс роста, жизнедеятельности и отмирания микроорганизмов (клеток) в культуральной среде представляет собой совокуп- ность четырёх различных взаимосвязанных про- цессов. 1. Процесс роста (размножения) клеток расту- щей культуры микроорганизмов. 2. Процесс потребления субстрата растущими микроорганизмами. 3. Процесс продуцирования метаболита расту- щими микроорганизмами. 4. Процесс отмирания пассивных клеток расту- щей культуры микроорганизмов со временем. Скорость каждого из четырёх указанных выше процессов обусловлена фундаментальным постулатом природы: скорость микробиологического процесса, связанного с ростом, жизнедеятельно- стью и выживанием микроорганизмов в изуча- емой биологической пробе (бактериальном кон- центрате), при неизменности основных физико- химических параметров биологической пробы прямо пропорциональна изменяющейся общей концентрации микроорганизмов (Хобщ) в био- логической пробе [3]. Этот фундаментальный постулат, по нашему мнению, лежит в основе системы четырёх концеп- туальных (основополагающих) уравнений: (1), (2), (3), (4), из которых, как показано ниже, вытекают все фундаментальные законы и закономерности роста, жизнедеятельности и отмирания микроорга- низмов [3]. Каждое из приведенных ниже четырёх концеп- туальных уравнений давно известно микробиоло- гам, которые не считали необходимым как-то вы- делить их из множества известных теоретических уравнений, не считали их концептуальными (ос- 117 ISSN 2074-9414. Техника и технология пищевых производств. 2015. Т. 37. № 2 новополагающими) и, как правило, рассматривали их отдельно, а не как единую основополагающую систему. Например, в фундаментальной моногра- фии С.Дж. Перта [9] четыре (концептуальных) уравнения приведены и рассмотрены им раздельно, в различных главах. Система обозначений, исполь- зованная С.Дж. Пертом, не совпадает с общеприня- той, поэтому концептуальные уравнения приведе- ны также и в его редакции. Ниже указаны номер главы и раздела в монографии С.Дж. Перта (в рус- ском переводе), а также принятая С.Дж. Пертом нумерация уравнения и страница, на которой оно приведено: dXобщ/dt = µ Xобщ (1) dX/dt = µ· X (п. 4.1, с. 37), - dS/dt = q Xобщ (2) dS/dt = q· X (п. 2.16, с. 18), dM/dt = γ Xобщ (3) dР/dt = qР ·X (п. 16.1, с. 191), - dХпас/dt = λ Хпасс (4) dyv /dt = - k · yv (п. 7.1, с. 75). где: dXобщ/dt - скорость увеличения общей концен- трации клеток растущей культуры микроорганиз- мов в культуральной среде; (-dS/dt) - скорость од- новременного уменьшения концентрации компо- нентов субстрата в той же среде, потребляемых растущими клетками; dМ/dt - скорость одновре- менного увеличения концентрации метаболита в той же среде, продуцируемого растущими клетка- ми; (- dХпас/dt) - cкорость уменьшения концентра- ции (Хпас) пассивных клеток в биологической пробе; µ - удельная скорость роста клеток, ч-1; q - удельная скорость потребления субстрата рас- тущими клетками, ч-1 ; γ - удельная скорость про- дуцирования метаболита растущими клетками, ч-1; λ - удельная скорость отмирания пассивных кле- ток, ч-1; (Xакт)t - концентрация активных (расту- щих) клеток в культуральной среде через t часов культивирования; (Xпас)t - концентрация пассивных (покоящихся) клеток в биологической пробе через t часов хранения пробы. Покажем, как из концептуального уравнения (1) вытекает уравнение Закона экспоненциального роста микроорганизмов (6). Одновременно проана- лизируем обоснованность предложенных в нашей статье изменений в формулировке и трактовке об- щепризнанного уравнения (6) фундаментального Первого закона общей микробиологии, которое оставалось неизменным с момента его открытия А. Фелпсом. dXобщ/dt = µ Xобщ - первое концептуальное уравнение, dXобщ/ Xобщ = µ dt , (5) (Хобщ)t = (Xобщ)о · eµt - известное уравнение Закона экспоненциального роста. (6) В 1936 г. микробиологи считали, что все живые клетки экспоненциально растущей культуры явля- ются активными (растущими) клетками на всём протяжении фазы экспоненциального роста куль- туры. Отметим, что только при этом условии при- веденный выше теоретический вывод уравнения (6) и само уравнение (6) можно считать абсолютно верными. (Как показано нами ниже, это обязатель- ное условие абсолютно невыполнимо). При объединении первого и второго концептуальных уравнений и последующем их интегрирова- нии получим фундаментальную классическую формулу Ролэна, открытую в 1869 г. : dXобщ/ µ = Xобщ dt = - dS/q , отсюда: ΔXобщ / µ = -ΔS / q (7) ΔXобщ = - ΔS · (µ/q) = Y · (- ΔS) , где Y = (µ/q) - формула Ролэна. (8) Интегрируя систему первых трёх концептуальных уравнений получим исходное уравнение нового фун- даментального Закона прямой пропорциональности: (ΔXобщ)t = Y·(- ΔSt) = Z·ΔMt [1] В 1975 г. С.Дж. Перт в своей фундаментальной монографии, посвящённой основам культивирова- ния микроорганизмов и клеток, впервые кратко сообщил, что активные микроорганизмы культу- ральной среды могут терять способность к росту и становиться пассивными (покоящимися) живыми клетками. Пассивные клетки не растут, т.е. не раз- множаются, но в отличие от мёртвых клеток могут превращаться в нормальные растущие клетки [9]. К сожалению, эти сведения в монографии С.Дж. Пер- та так и не были им использованы для создания новой теории пассивации и активации живых кле- ток в процессе роста культуры микроорганизмов. Исследования, проведенные нами через 25 лет в ВНИМИ, показали, что любая растущая культура микроорганизмов одновременно содержит актив- ные (растущие) и пассивные (покоящиеся) клетки. Поэтому общая концентрация живых клеток в культуральной среде в самом начале экспоненци- ального роста культуры, (Хобщ)о равна сумме кон- центраций активных (Xакт)о и пассивных (Хпас)о кле- ток в культуральной среде: (Хобщ)о = (Xакт)о + (Хпас)о (9) В экспоненциально растущей культуре экспо- ненциально возрастает концентрация только актив- ных (растущих) клеток, пассивные клетки не рас- тут. Следовательно, режим роста всех живых кле- ток культуры, включая пассивные клетки, не явля- ется строго экспоненциальным вопреки известному уравнению (6): 118 ISSN 2074-9414. Food Processing: Techniques and Technology. 2015. Vol. 37. № 2 (Хобщ)t = (Xакт)о · eµt + (Хпас)о ≠ ≠ [ (Xакт)о + (Хпас)о] · eµt (10) Так как пассивные клетки растущей культуры микроорганизмов не растут, то dXпас/dt = 0. Поэто- му скорость роста культуры в целом dХобщ/dt равна скорости роста только активных клеток культуры (dXакт/dt): dХобщ/dt = dXакт/dt + dXпас/dt = = dXакт/dt + 0 = dXакт/dt (11) dXобщ/dt = dXакт/dt = µ·Xакт - уточнённое первое концептуальное уравнение (1а) Следует отметить, что уравнение (1) было сфор- мулировано великим микробиологом Жаком Моно в середине прошлого века, когда о пассивных клетках микробиологи ещё ничего не знали. Поэтому и кон- цептуальное уравнение (1) (выбранное автором в 2003 г. из творческого наследия Ж. Моно [3]) тоже не учитывало неизвестное тогда явление непрерыв- ной пассивации активных клеток культуральной среды при экспоненциальном росте культуры, от- крытое нами только 11 лет спустя в 2014 г. [11]. Для практического использования уравнения (1а) его необходимо дополнительно преобразовать, так как величину параметра Xакт трудно определить общепринятыми методами. При этом микробиологи могут достаточно точно и оперативно определить общую концентрацию жи- вых клеток (Xобщ) в культуральной среде, поэтому преобразуем уравнение (1) в уравнения (12 и 13): dХобщ/dt = µ Xакт = µ ( Xакт/ Хобщ) · Хобщ = = α µ ·Хобщ = µэфф · Хобщ (12) dХобщ/dt = α µ ·Хобщ = µэфф · Хобщ - обновлённое первое концептуальное уравнение (13) где α = ( Xакт / Хобщ) = µэфф / µ < 1,0, так как Xакт < Хобщ . (14) Обновлённое автором первое концептуальное уравнение (13) в отличие от всех теоретических уравнений, опубликованных микробиологами ранее в статьях и монографиях в России и за рубежом (до декабря 2014 г.), впервые в мире в явном виде учитывает влияние непрерывной пассивации части растущих клеток культуральной среды на скорость роста культуры микроорганизмов. В 2014 г. нами также впервые установлено, что относительная доля активных клеток α в культу- ральной среде экспоненциально растущей культу- ры микроорганизмов максимальна в самом начале фазы экспоненциального роста культуры и посте- пенно уменьшается (до нуля ) в конце фазы экспо- ненциального роста. [11]. В середине прошлого века микробиологи-исследователи неоднократно отмечали постепенное уменьшение величины µ на всём протяжении фазы экспоненциального роста. Однако в действительности уменьшалась величина µэфф = α µ из-за постепенного уменьшения относи- тельной доли активных клеток α в культуральной среде. Удельная скорость роста клеток µ при этом оставалась неизменной: µ = соnst. Во время начальной стадии экспоненциального роста скорость уменьшения величины α сравни- тельно невелика и её (в начале экспоненциального роста) можно условно считать относительно неиз- менной [12]. При этом условии разделим перемен- ные и проинтегрируем уравнение (13): dХобщ/ Хобщ = α µ · dt - обновлённое уравнение (5) (15) (Хобщ)t = (Хобщ)о · e αµ · t - обновлённое уравнение Закона экспоненциального роста (16) где α· µ = µэфф = const (условно, в самом начале фазы экспоненциального роста). Таким образом, реальная закономерность изме- нения параметра (Хобщ)t в уравнении (15) очень близка к экспоненциальной только в самом начале фазы экспоненциального роста культуры. С увели- чением продолжительности экспоненциального роста скорость уменьшения величины (α·µ = µэфф) заметно возрастает и поэтому реальный режим ро- ста культуры будет всё больше отличаться от стро- го экспоненциального [11]. Сопоставим уравнение (15) с уравнением (5). Эти оба уравнения полностью совпадут, т.е. станут тождественными, только при обязательном усло- вии, что величина α = 1,0. Однако это условие не- выполнимо из-за открытого нами в 2014 г. явления непрерывной пассивации активных клеток на всём протяжении фазы экспоненциального роста микро- организмов. При α = 1,0 пассивация активных кле- ток растущей культуры отсутствует, что невозмож- но, так как противоречит однозначно установлен- ным результатам экспериментов [11]. Вернёмся к уравнению (16). В конце фазы экс- поненциального роста величина µэфф быстро сни- жается (до нуля), согласно выведенной нами ранее новой формуле Жака Моно (J. Monod) [11]: µэфф ( = α · µ) = µ · S / ( KS + S) = = µ / ( KS /S + 1) - новая формула Жака Моно (17) где µ = µmax = соnst. В заключительной стадии фазы экспоненциаль- ного роста культуры коэффициент e αµ · t (в обновлённом уравнении Закона экспоненциального роста микроорганизмов) быстро уменьшается (до 1,0), а µэфф → 0. Скорость роста культуры перестаёт возрастать, и режим роста культуры перестаёт быть экспоненциальным. Тем не менее, несмотря на все отмеченные нами случаи отклонения режима экспоненциального ро- ста микроорганизмов от идеального, строго экспо- ненциального режима, Закон экспоненциального роста был и остаётся фундаментальным Законом Природы. Наблюдаемые в микробиологических исследованиях отклонения от этого закона побуж- 119 ISSN 2074-9414. Техника и технология пищевых производств. 2015. Т. 37. № 2 дают нас не отвергать его по формальным причи- нам, не делать необдуманный вывод, что этот Закон «не так идеален, как мы ошибочно считали, и его следует отменить», а наоборот, ещё глубже вникать в суть этого фундаментального Закона Природы и уточнять границы его применимости. Точно так же следует поступать и при рассмот- рении ещё не признанного Третьего фундаменталь- ного Закона общей микробиологии, который упро- щённо можно было бы назвать Законом экспонен- циального снижения выживаемости пассивных микроорганизмов в биологической пробе со време- нем при хранении. В основе процесса отмирания и выживания микробных клеток пассивной культуры микроорга- низмов лежит четвёртое концептуальное уравнение (4) и вытекающие из него уравнения (19) и (20). Эти уравнения регламентируют экспоненциальное снижение (уменьшение) концентрации (Хпас)t вы- живших клеток данного вида микроорганизмов в биологической пробе после t часов хранения и од- нотипное экспоненциальное снижение выживаемо- сти Вt пассивных (покоящихся) клеток в биологи- ческой пробе после t часов хранения. (Это же кон- цептуальное уравнение (4) лежит и в основе более сложного процесса отмирания клеток в растущей культуре микроорганизмов, который мы рассмот- рим в отдельной публикации.) - dХпас/dt = λ · Хпас - четвёртое концептуальное уравнение отмирания пассивных микроорганизмов (4), где Хпас - концентрация пассивных клеток данного вида микроорганизмов в жидкой охлаждённой, су- хой или замороженной пробе, т.е. в условиях, ис- ключающих рост клеток, λ - удельная скорость отмирания пассивных клеток, [ч-1], t - продолжи- тельность процесса выживания пассивных клеток в режиме хранения. Знак «минус» (-) в левой части концептуального уравнения (4) обусловлен тем, что параметры Хпас и t изменяются в противоположных направлениях: при увеличении t параметр Хпас уменьшается, (- dХпас/dt ) > 0. При неизменности температуры и других основных физико-химических параметров пробы величина λ остаётся неизменной биологи- ческой константой, характеризующей процесс вы- живания клеток в неизменных (заданных) условиях хранения. Чем больше величина λ, тем больше ско- рость отмирания клеток и тем меньше выживае- мость клеток при хранении в условиях, исключаю- щих рост клеток. Известно, что скорость распада ядер атомов ра- диоактивного изотопа (- dN/dt > 0) также описыва- ется уравнением (4), хотя процессы радиоактивного распада и выживания пассивных клеток в принципе различны. Следовательно, подчинение двух разных природных процессов одной и той же фундаментальной закономерности не означает, что эти процессы должны быть однотипны. Отметим, что ско- рость радиоактивного распада (- dN/dt = λ·N) и константа скорости радиоактивного распада λ не зависят от температуры изотопа, тогда как биоло- гическая константа удельной скорости отмирания пассивных клеток λ остаётся неизменной только при неизменной температуре биологической пробы. Возвращаясь к концептуальному уравнению (4), после разделения переменных и интегрирования получим уравнение (19) Закона экспоненциального снижения со временем концентрации выживших пассивных клеток в биологической пробе (бактери- альном концентрате) при неизменных условиях хранения. ln [(Хпас)t / (Хпас)о] = - λ · t (18) (Хпас)t = (Хпас)о · e- λt - концентрация выживших пассивных клеток в пробе после t ч хранения, (19) Вt = (Хпас)t /(Хпас)о = e- λt - выживаемость пассивных клеток после t ч хранения, (20) ln Вt = ln [(Хпас)t / (Хпас)о] = - λ · t, (21) (Хпас)о - (Хпас)t = -Δ(Хпас)о = (Хпас)о· (1- e- λt) - прирост концентрации мёртвых клеток за t час. (22) где - d(Хпас)о/dt - скорость уменьшения концентра- ции данного вида пассивных микроорганизмов вы- живших в биологической пробе при хранении её в неизменных условиях, при которых не происходит роста клеток; (Хпас)о и (Хпас)t - концентрации живых клеток в пробе в момент начала хранения, (t = 0), и, соответственно, через t часов хранения; λ - удель- ная скорость отмирания клеток данного вида микро- организмов в пробе при неизменных (заданных) условиях её хранения, ч-1; Вt - выживаемость данно- го вида микроорганизмов в пробе через t часов хра- нения, безразмерная величина (0 < Вt < 1). Удельная скорость отмирания пассивных клеток (λ) аналогична удельной скорости роста активных клеток культуры (µ) и имеет ту же размерность [ч-1]. Бегло отметим, что параметры λ и Т0,5 взаи- мосвязаны уравнением (23), аналогично тому, как связаны друг с другом параметры µ и G (см. урав- нение 24): λ · Т0,5 = ln 2 = 0, 693 - для выживающих пассивных клеток (см. уравнение (12)) (23) µ · G = ln 2 = 0, 693 - для экспоненциально растущих активных клеток (24) Согласно уравнениям (19) и (20) концентрация (Хпас)t выживших пассивных клеток в биологиче- ской пробе и их выживаемость Вt экспоненциально уменьшаются со временем. В уравнениях (19) и (20) сомножитель e-λt не имеет размерности, так как размерность параметров (Хпас)о и (Хпас)t одина- кова. Поэтому показатель степени (- λ · t) также является безразмерной величиной. Если параметр t имеет размерность [ч], то величина удельной ско- 120 ISSN 2074-9414. Food Processing: Techniques and Technology. 2015. Vol. 37. № 2 рости отмирания клеток λ должна иметь размер- ность [час.-1], т.е. ту же размерность, что и три биологические константы трёх первых концепту- альных уравнений: µ , q и γ. Исследователь должен чётко сознавать, что если в процессе хранения часть клеток перестанет быть пассивной (т.е. начнёт размножаться), то об экспо- ненциальном снижении концентрации выживших пассивных микроорганизмов не может быть и речи. (Концентрация живых клеток может не снижаться, а возрастать). Аналогичным образом, если температуру хра- нения не будут поддерживать неизменной, а на ка- ком-то отдельном этапе она будет (предположим) возрастать, то это приведёт к возрастанию величи- ны удельной скорости отмирания клеток λ и на этом отдельном этапе изменится скорость процес- са выживания клеток. В результате первоначальная экспоненциальная зависимость (Хпас)t от t изменится на отмеченном этапе процесса хранения и будет искажена общая экспоненциальная зависимость (Хпас)t от t за весь период хранения. В наши дни непризнанный Закон экспоненци- ального снижения со временем концентрации вы- живших пассивных клеток в биологических пробах известен в виде частной закономерности экспонен- циального снижения численности микроорганиз- мов при пастеризации и термической стерилизации. Область применения Третьего закона в целом вы- ходит далеко за рамки режимов пастеризации и стерилизации. Однако за пределами этих рамок он, как правило, не применяется. Например, практиче- ски неизвестно, что выживание микроорганизмов в охлаждённых или замороженных средах, кисломо- лочных продуктах, лекарственных препаратах, бак- териальных концентратах и т.д., в том числе полу- ченных путём криогенного замораживания и лио- фильной сушки, подчиняется этому Закону. Всё сказанное выше позволяет сделать вывод, что существует единая фундаментальная законо- мерность экспоненциального снижения со време- нем выживаемости различных видов микроорга- низмов в изучаемых пробах в разных средах при разных температурах хранения и разных видах бак- терицидного воздействия окружающей среды, ко- торую следует рассматривать не как частную закономерность процесса термической стерилизации, а как фундаментальный Закон Природы. При хранении охлаждённых жидких кисломо- лочных продуктов, а также сухих или заморожен- ных биологических проб (все живые клетки пассивны, не растут) практически значимым критери- ем, кроме периода полувыживания Т0,5 , является также период десятикратного уменьшения кон- центрации выживших пассивных клеток Т0,1 в про- дукте (пробе) во время хранения. Применение кри- терия Т0,1 позволяет использовать в расчётах деся- тичные логарифмы, вместо натуральных и тем са- мым облегчает расчёты. Рассчитаем соотношения: T0,5 / T0,1 , а также t / Т0,1 : (λ · Т0,5) / ( λ · Т0,1) = ln 2 / ln 10 = lg 2 / lg 10 = = lg 2 = 0,3 = Т0,5 / Т0,1 ; Т0,5 = 0,3 Т0,1 (25) - λ · t = ln [(Хпас)t / (Хпас)о] = ln Вt, (21) λ · Т0,1 = ln [(Хпас)о /(Хпас)t] = ln 10. (22) Разделим уравнение (21) на уравнение (22): (- λ· t ) / (λ · Т0,1) = - t / Т0,1 = ln Вt / ln10 = = lg Вt / lg 10 = lg Вt = lg [(Хпас)t / (Хпас)о] = = - t / Т0,1, (23) Т0,1 = t / lg [(Хпас)о /(Хпас)t] = t / (- lg Вt) ; аналогично - lg Вt = lg [(Хпас)о /(Хпас)t] = t / Т0,1 (24) Если экспериментально изучена зависимость (Хпас)t от t , то по уравнению (24) можно рассчитать Т0,1 . Для примера рассчитаем продолжительность периода десятикратного снижения выживаемости пассивных клеток бифидобактерий (Т0,1) при хра- нении их в жидкой сывороточной среде при 4 °С по экспериментальным данным Г.И. Новик с сотр. [12], приведенным в табл. 1. На рис. 1 графически представлены экспери- ментальные зависимости (23) и (24) по данным табл. 1. Таблица 1 Выживаемость бифидобактерий в жидкой сыворочной среде при 4 °С Штамм B. bifidum 791 Продолжительность хранения (t), суток при 4 °С Штамм B. bifidum 791 0 30 60 100 130 (Хпас)t · 10-8 200 81 7,5 3,0 0,5 Расчетные данные (Хпас)о /(Хпас)t 1 2,469 26,67 66,67 400 lg (Хпас)о /(Хпас)t 0 0,3925 1,426 1,824 2,602 lg Bt 0 -0,3925 -1,426 -1,824 -2,602 121 ISSN 2074-9414. Техника и технология пищевых производств. 2015. Т. 37. № 2 Рис. 1. Зависимость логарифма выживаемости (lg Вt) бифидобактерий в жидкой сывороточной среде от продолжительности хранения (t ) пассивной культуры при 4 °С (нижняя прямая) В рассматриваемом примере точка с координа- тами: t = 130 суток, lg Вt = - 2,602 (из табл. 1) лежит на усреднённой нижней прямой графика (рис. 1), поэтому эти значения можно использовать для расчёта. Т0,1 = - t / lg Вt = t / (- lg Вt) = = 130 / 2,6 = 50 суток = 1200 ч, T0,5 = 0,3·T0,1 = 15 суток = 360 ч, λ = ln 10 / T0,1 = 2,3 / 1200 = 1,9·10-3 [ч-1], - lg Вt = t / Т0,1 . Обе логарифмические зависимости, приведен- ные на рис. 1, прямолинейны, что свидетельствует об экспоненциальном характере снижения выжива- емости Вt бифидобактерий при хранении их в жид- кой сывороточной среде. Рост бифидобактерий в условиях хранения отсутствует, живые клетки пас- сивированы. Жидкая сывороточная среда при 4 °С является для бифидобактерий не питательной, а инертной средой. В противном случае рост бифи- добактерий привёл бы к нарушению прямолиней- ности зависимости на рис. 1. На рис. 2 приведены бегло упомянутые (в нача- ле статьи) Дж. Мейнеллом [2] кривые выживания клеток и кратко проанализирован процесс выжива- ния пассивных клеток лиофильно высушенного во ВНИМИ бактериального концентрата L. acidophilus в режиме хранения его при неизменной температу- ре (-18 °С) [13]. Рис. 2. Кривые выживания бактериальных клеток лиофильно высушенных проб бакконцентратов L. acidophilus при хранении их при - 18 °С Bерхняя кривая выживания пассивных клеток сухого бактериального концентрата L. acidophilus при хранении полностью соответствует теоретиче- ской закономерности (4). При этом продолжитель- ность периода полувыживания (T0,5) ацидофильных палочек в режиме хранения при -18 °С, по результа- там эксперимента составила 3,7 месяца (= 27 084 ч). Другими словами, через любые 3,7 месяца хране- ния (подряд) концентрация живых клеток в сухом бактериальном концентрате уменьшалась в 2 раза. Экспериментально определив продолжительность T0,5 , легко рассчитать по уравнению (19) удельную скорость отмирания λ пассивных клеток L. acidophilus в выбранных условиях хранения бак- териального концентрата: λ · Т0,5 = 0, 693, (23) λ = 0, 693/ Т0,5 = 0,693 / 27084 ч = = 2,56 · 10-5 [ч-1] (25) Напомним, что удельная скорость отмирания клеток бифидобактерий в жидкой среде при 4 °С, рассчитанная нами по результатам экспериментов Г.И. Новик с сотр., была в 74 раза выше. В жидкой среде, при более высокой температуре (4 °С) клет- ки бифидобактерий отмирали во много раз быстрее, чем клетки ацидофильных палочек при -18 °С в сухом замороженном бакконцентрате. Отчасти различие скоростей отмирания клеток могло быть обусловлено спецификой отличий изучаемых мик- роорганизмов. Однако основной причиной улучше- ния выживаемости клеток стало, безусловно, сни- жение температуры хранения и сопутствующее изменение агрегатного состояния бакконцентрата. Как правило, стабильный режим выживания клеток лактобактерий по экспоненциальному зако- ну при производстве и хранении лиофильно высу- шенного бактериального концентрата наступает не сразу, а через 1-2 месяца после начала хранения бакконцентрата. Это очевидно из двух нижних кри- вых выживания клеток (II и III) однотипных бак- концентратов L. acidophilus , выработанных с ис- пользованием других защитных сред. По нашему мнению, отмеченное явление обусловлено тем, что в первые месяцы хранения с более высокой скоро- стью отмирают клетки, получившие повреждения на стадии замораживания и высушивания влажного бактериального концентрата и тем самым снизив- шие свою жизнеспособность. Последующее выжи- вание основного количества живых клеток, остав- шихся неповрежденными (или с незначительными повреждениями), как правило, протекает по экс- поненциальному закону. Согласно нормативной документации концен- трация живых клеток в сухом бактериальном кон- центрате ацидофильных палочек должна быть не менее 1·1010 КОЕ/г. Поэтому срок хранения бакте- риального концентрата лактобактерий существенно возрастает при увеличении исходной концентрации в нем живых клеток. В связи с этим, наряду с за- планированным совершенствованием защитных сред, во ВНИМИ будут продолжены исследования 122 ISSN 2074-9414. Food Processing: Techniques and Technology. 2015. Vol. 37. № 2 по повышению урожайности питательных сред для культивирования лактобактерий и бифидобактерий при производстве сухих и жидких бактериальных концентратов. По «экспоненциальному закону» происходит выживание пассивных клеток лактобактерий в су- хих кисломолочных продуктах при хранении. По этому же закону протекает выживание споровых форм микроорганизмов при высоких температурах пастеризации и стерилизации. Кроме того, по Тре- тьему закону протекает процесс выживания пас- сивных клеток под действием токсичных для кле- ток веществ, причём в условиях, когда термическая пастеризация и стерилизация отсутствуют. Во всех приведенных примерах микроорганизмы практиче- ски полностью находятся в пассивной (покоящей- ся) форме. Детальное рассмотрение этих процессов выходит за рамки данной публикации, и они будут проанализированы в отдельной статье. Сейчас микробиологи в своих исследованиях всё чаще успешно используют частные закономер- ности временно не признанного фундаментального Третьего закона общей микробиологии. Поэтому единичные (случайные или ошибочные) расхожде- ния, причины которых нам ещё предстоит выяс- нить, не могут рассматриваться сообществом мик- робиологов как недопустимые отклонения, дезаву- ирующие Закон Природы.

1. Mar'in, V.A. Nekotorye fundamental'nye osobennosti rosta mikroorganizmov / V.A. Mar'in, D.V. Haritonov // Nauchnoe obespechenie molochnoy promyshlennosti: sbornik nauchn. trudov GNU VNIMI Rossel'hozakademii. - M.: Intel- lekt-Centr, 2012. - S.146-159.

2. Meynell, Dzh. Eksperimental'naya mikrobiologiya. Teoriya i praktika / Dzh. Meynell, E. Meynell; per. s angl. - M.: MIR, 1967. - 347 s.

3. Mar'in, V.A. Novyy zakon rosta mikroorganizmov / V.A. Mar'in // sb. nauchnyh trudov, posv. 80-letiyu N.N. Lipatova. GNU VNIMI. - M., 2003. - S. 142-146.

4. Mar'in, V.A. Zakon pryamoy proporcional'nosti sopryazhennyh izmeneniy koncentracii biomassy, substrata i metabolita v processe rosta mikroorganizmov / V.A. Mar'in // Nauchnoe obespechenie molochnoy promyshlennosti (VNI- MI-75 let): sb. nauchn. trudov. - M., 2004. - S. 211-216.

5. Mar'in, V.A. Novaya faza rosta mikroorganizmov - faza lineynogo rosta / V.A. Mar'in // Nano- i biotehnologiya proizvodstva produktov funkcional'nogo naznacheniya: sb. dokl. mezhd. nauch.- prakt. konf. Rossel'hozakademii. Krasnodarskiy NII hraneniya i pererabotki s.-h produkcii. - 2007. - S. 176-177.

6. Mar'in, V.A. Faza lineynogo rosta - osnovnaya faza rosta molochnokislyh mikroorganizmov / V.A. Mar'in, E.I. Raydna // Kislomolochnye produkty - tehnologii i pitanie: sb. tez. Regional'noy konf. Mezhdunarodnoy molochnoy federacii, 17.05.2007. - M., 2007. - S. 319-320.

7. Mar'in, V.A. Dvadcatikratnoe uvelichenie urozhaynosti zhidkogo i suhogo koncentrata bifidobakteriy (do 5·1011 KOE/g) obogascheniem pitatel'noy sredy kompleksom makro- i mikroelementov / V.A. Mar'in // Principy pischevoy kombi- natoriki - osnova modelirovaniya polikomponentnyh pischevyh produktov: sb. mat. vseross. nauch.-prakt. konf. - Uglich. GNU VNIIMS Rossel'hozakademii. 8-9. 09. 2010. - S. 162-165.

8. Mar'in, V.A. Issledovanie shem posledovatel'nosti faz rosta periodicheskoy kul'tury bifidobakteriy ili laktobakteriy / V.A. Mar'in, D.V. Haritonov // Tehnika i tehnologiya pischevyh proizvodstv. - 2010. - № 4. - S. 24-28.

9. Pert, S.Dzh. Osnovy kul'tivirovaniya mikroorganizmov i kletok / S.Dzh. Pert. - M.: «Mir», 1978. - S. 16, 75.

10. Mar'in, V.A. Lineynyy rost i passivaciya aktivnyh kletok rastuschey kul'tury mikroorganizmov / V.A. Mar'in, D.V. Haritonov // Tehnika i tehnologiya pischevyh proizvodstv. - 2014. - № 4. - S. 97-104.

11. Mar'in, V.A. Strogo eksponencial'nyy rost mikroorganizmov teoreticheski nevozmozhen, real'no neosuschestvim / V.A.Mar'in, D.V. Haritonov // Trudy Belorusskogo gosudarstvennogo universiteta. Fiziologicheskie, biohimiche- skie i molekulyarnye osnovy funkcionirovaniya biosistem. - Minsk, 2015. - T.10. - Ch.2. - S. 87.

12. Novik, G.I. Sohranenie zhiznesposobnosti i fiziologicheskih svoystv bifidobakteriy pri kriokonservacii i liofilizacii / G.I. Novik, N.I. Astapovich, N.G. Kadnikova, N.E. Ryabaya // Mikrobiologiya. - 1998. - T. 67. - № 5. - S. 637-642.

13. Raskoshnaya, T.A. Sovershenstvovanie biotehnologii bakterial'nogo koncentrata acidofil'nyh molochnokislyh palochek dlya proizvodstva kislomolochnyh produktov: avtoref.. dis. kand. tehn. nauk / T.A. Raskoshnaya; GNU VNIMI. - M.,2012. - 20 s.