Russian Federation
Russian Federation
UDK 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
GRNTI 68.01 Общие вопросы сельского хозяйства
The aim of the study is to optimize the conditions for in vitro cultivation of blue honeysuckle, raspberry and strawberry. The work was carried out in 2012-2020. The Murasige-Skuga medium (1/2 MS) was the control for all cultures for the initiation of explants. Additionally, we used a modified nutrient medium 1/2 MS with a reduced NH4 content by 15 % compared to the base MS; and Woodi Plant Medium (1/2 WPM) for honeysuckle; for raspberries - Quoirin-Lepoivre (1/2 QL) and 1/2 Anderson; for strawberries - 1/2 MS. For micropropagation and rooting, the following media were used: honeysuckle - modified MS and WPM; raspberries - QL and Anderson; strawberries - MS modified by Siliplant and Boksyu; control for all - MS. The following growth regulators were added to the optimal each culture a nutrient medium: 6-benzylaminopurine (6-BAP), gibberellic acid (GA), waste products of the large wax moth larvae, indolyl-3-butyric acid (IBA), Siliplant, EcoFus, HB-101. The effect of LED-phytoirradiators with a combination of red, blue and white light in the spectrum 2: 1: 1, 1: 1: 1, 2: 1, respectively, and LED-irradiators with a changing spectrum and flashing were studied at the stages of micropropagation and rooting in all cultures. The survival rate of honeysuckle explants on 1/2 WPM medium was 62.2 % (control 27.9 %). The highest reproduction factor of 5.1 (control 2.6) was achieved when using LED 2 red : 1 blue : 1 white on MS modified + 6-BAP 1.0 mg/L + kinetin 0.5 mg/L, and high rooting rate of honeysuckle 89.0 % (76.0 % k) was achieved on MS modified + IBA 0.5 mg/L. Cultivation of red raspberries on QL + 6-BAP 1.0 mg/L + GA 0.5 mg/L and LED irradiation 2 red : 1 blue : 1 white provided a reproduction factor of 5.3 (control 2.7), addition of IBA 0.5 mg/L + HB-101 100 μL/L in QL and LED irradiation 1 red : 1 blue : 1 white contributed to 100 % rooting. The addition of 6-BAP 1.0 mg/L + IBA 0.2 mg/L + GA 0.5 mg/L in QL and LED lighting 1 red : 1 blue : 1 white increased the reproduction factor of remontant raspberries by 1.6 times (from 2, 6 to 4.1), and the use of QL + IBA 0.5 mg/L + HB-101 50 μL/L and LED 2 red : 1 blue : 1 white increased its rooting ability to 96 % (control 67 %). LED irradiation with a changing spectrum during cultivation of garden strawberries on MS + Siliplant + EcoFus at 0.5 ml/L provided a reproduction factor of 5.9 (control 3.8), and the reproduction factor of remontant strawberries on MS + HB-101 100 μl/L was 7.4 (control 5.6). The addition of IBA 0.5 mg/L + HB-101 100 μL/L to the MS promoted the rooting of garden strawberries of 100 % when using a LED irradiator with a changing spectrum, and remontant strawberries – with a blinking LED irradiator
Honeysuckle blue (Lonicera caerulea), raspberry ordinary (Rubus idaeus), strawberry garden (Fragaria ananassa), clonal micropropagation, LED phytoirradiator
Клональное микроразмножение ягодных и других растений – наиболее надежный и перспективный метод, позволяющий производить посадочный материал, свободный от различных заболеваний [1]. Работу в лабораторных условиях осуществляют круглый год, нужную партию растений можно сформировать к определенному сроку, иногда за очень короткий промежуток времени [2].
Оптимальная питательная среда, регуляторы роста и спектральный состав света – самые важные факторы биопродуктивности растений in vitro [3].
При производстве посадочного материала метод клонального микроразмножения дает ряд преимуществ, по сравнению с традиционным черенкованием и прививкой, поэтому также очень важен вопрос экономической эффективности [4].
Цель исследований – совершенствование биотехнологических методов выращивания жимолости синей, малины и земляники.
Условия, материалы и методы. Эксперименты проводили в 2012–2020 гг. согласно методическим указаниям «Технологический процесс получения оздоровленного от вирусов посадочного материала плодовых и ягодных культур» (2013) и ГОСТ Р 54051-2010 «Плодовые и ягодные культуры. Стерильные культуры и адаптированные микрорастения. Технические условия».
Объектами служили: на этапе введения в культуру ткани – инициальные экспланты, на этапе собственно микроразмножения – микрочеренки, на этапе адаптации – микрорастения жимолости синей, малины красной и ремонтантной, земляники садовой и ремонтантной.
На этапе введения в стерильную культуру для всех культур использовали питательные среды с половинной дозой макро- и микросолей, контрольной была среда Мурасиге-Скуга (1/2МС). Дополнительно изучали возможность использования для жимолости 1/2 МС модифицированную с уменьшенным на 15 %, по сравнению с базовой МС, содержанием аммиачного азота NH4 и Woodi Plant Medium (1/2 WPM); для малины – Quoirin-Lepoivre (1/2 QL) и 1/2 Андерсона. Для земляники на этом этапе другие питательные среды не использовали.
Стерилизовали экспланты 33 %-ным раствором пергидроли.
На этапах собственно микроразмножения (5 пассажей) и укоренения использовали следующие питательные среды: для жимолости –
МС модифицированная, WPM; для малины – QL, Андерсона; для земляники – МС модифицированная Силиплантом, Боксю; контрольной для всех культур служила среда МС. В оптимально выделившуюся для каждой культуры питательную среду перед автоклавированием вносили различные регуляторы роста: 6-БАП – 6-бензиламинопурин, ГК – гиббереллиновая кислота, ПЖВМ – продукты жизнедеятельности личинок большой восковой моли, ИМК – индолил-3-масляная кислота (табл. 1).
Дополнительно на этапах собственно микроразмножения и укоренения на всех культурах изучали действие светодиодных фитооблучателей (СД-облучатель) с сочетанием в спектре красного, синего и белого света соответственно 2:1:1, 1:1:1, 2:1 [6], СД-облучателей с меняющимся спектром и мигающего. Последние два фитооблучателя применяли также на этапе адаптации земляники. Контрольным был люминесцентный фитооблучатель. Фотопериод составлял 14 ч, освещенность – 75…85 мМоль/м2×сек-1, 6500 К, температура воздуха – 22…27 0С, влажность – 50…60 % [7]. Экспериментальные светодиодные фитооблучатели с различными характеристиками, которые, наряду с экономией электроэнергии, улучшают качество освещения микрорастений, разработаны в ФГБОУ «Ижевская ГСХА» [8].
На этапе адаптации использовали субстраты на основе низинного торфа и речного песка в соотношении 3:1 (контроль), низинного торфа и вермикулита 3:1, верхового торфа [9].
Препараты с фитозащитными и ростостимулирующими свойствами применяли путем опрыскивания водными растворами [10].
В каждом варианте работали с объемом выборки 10 единиц, все опыты проводили в трехкратной повторности. Экспериментальные данные обработаны методом дисперсионного анализа по Доспехову Б. А. (М., 2001).
Анализ и обсуждение результатов. На этапе введения в стерильную культуру оптимальной для всех сортов жимолости была питательная среда 1/2 WPM, обеспечившая значительное увеличение выживаемости эксплантов до 62,2 %, в сравнении с контрольной
(27,9 %). Культивирование на среде 1/2 QL повышало выживаемость апексов малины красной в 1,7 раза, ремонтантной – в 1,3 раза. Выживаемость эксплантов земляники на среде 1/2 МС составила 81,5 %, поэтому в подборе оптимальной питательной среды на этапе введения в культуру не было необходимости.
Культивирование жимолости синей на питательной среде МС модифицированной с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + кинетин 0,5 мг/л при освещении светодиодным фитооблучателем со спектром 2К:1С:1Б способствовало увеличению коэффициента размножения (КР), в сравнении с контролем (2,6), в 2 раза
(табл. 2). Добавление в указанных условиях индуктора ризогенеза ИМК 0,5 мг/л обеспечило существенное увеличение укореняемости микрочеренков жимолости синей, в сравнении с контролем (76,0 %), до 89,0 %.
Культивирование малины красной на среде QL с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД 2К:1С:1Б повышало КР, в сравнении с контролем (2,7), практически в 2,0 раза (5,3). Внесение в питательную среду ГК 0,5 мг/л обеспечило увеличение высоты микрочеренков малины красной, в сравнении с контролем (1,2 см), до 1,8 см с последующей высадкой их на укоренение без этапа элонгации (удлинения). Укоренение микрочеренков малины красной на питательной среде QL с добавлением ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 100 мкл/л и освещении СД 1К:1С:1Б обеспечило 100 %-ный результат.
Культивирование малины ремонтантной на среде QL с добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + ИМК 0,2 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД
1К:1С:1Б повышало КР, в сравнении с контролем (2,6), в 1,6 раза. Внесение в питательную среду ГК 0,5 мг/л обеспечило увеличение высоты микрочеренков малины ремонтантной, в сравнении с контролем (1,5 см), в среднем до 3,0 см, что позволило высадить 70 % микрочеренков на укоренение также без этапа элонгации. Значительное увеличение укореняемости малины ремонтантной (до 96 %, при 67 % в контроле) отмечали при совместном внесении в среду QL ИМК 0,5 мг/л и НВ-101 50 мкл/л при облучении СД 2К:1С:1Б.
Максимальный в опыте КР микрочеренков земляники садовой (5,9) зафиксирован на среде МС при совместном использовании Силипланта и ЭкоФуса в концентрациях 0,5 мл/л и освещении СД с меняющимся спектром, в контроле величина этого показателя была на 2,1 меньше. Сокращению этапа укоренения микрочеренков земляники садовой до 10 суток (в контроле 20 суток) и 100 %-ному укоренению способствовало добавление в питательную среду НВ-101 в концентрации 100 мкл/л и освещение светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром. У земляники ремонтантной самый высокий КР отмечен также на среде МС с НВ-101 в концентрации 100 мкл/л при освещении светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром – 7,4 (в контроле 5,6). Укореняемость микрочеренков земляники ремонтантной составила 100 % на этой же питательной среде с добавлением ИМК
0,5 мг/л и НВ-101 в концентрации 100 мкл/л, но при освещении мигающим светодиодным фитооблучателем.
Применение Рибав-Экстра и освещение светодиодным мигающим фитооблучателем активизировало ризогенез микрочеренков земляники. Укореняемость земляники садовой на уровне 100 % отмечали через 10 суток после высадки при концентрации препарата 1,5 мл/л составила, ремонтантной – через 20 суток при концентрации 1,0 мл/л. Внесение в питательную среду ПЖВМ во всех дозах также значительно увеличивало укореняемость микрочеренков: у земляники садовой она достигала 86,4…100 %, ремонтантной – 88,9…100 % [11].
К концу этапа укорененные микрочеренки жимолости синей, малины и земляники соответствовали ГОСТ Р 54051-2010.
На этапе адаптации увеличение приживаемости микрорастений жимолости до 93,4 % обеспечило использование субстрата на основе верхового торфа в сочетании с обработкой 0,01 %-ным водным раствором НВ-101. В этом варианте выход кондиционных адаптированных микрорастений жимолости достиг
91,1 % при 67,9 % в контроле.
Выход 100 % адаптированных микрорастений малины красной и ремонтантной отмечен при использовании общепринятой методики.
Адаптацию укорененных микрочеренков земляники со 100 % приживаемостью обеспечило опрыскивание 0,1 %-ным водным раствором Силипланта и обработка 0,05 % смешанным раствором Силипланта с ЭкоФусом при освещении светодиодным фитооблучателем с меняющимся спектром. Кроме того, приживаемость 100 % микрорастений земляники садовой отмечали при опрыскивании 0,4 %-ным водным раствором ПЖВМ; приживаемость 99,8 % микрорастений земляники ремонтантной наблюдали при опрыскивании 0,6 %-ным водным раствором ПЖВМ.
При соблюдении перечисленных условий к концу этапа адаптированные микрорастения
жимолости синей, малины и земляники соответствовали ГОСТ Р 54051-2010.
Подбор оптимальных питательных сред, регуляторов роста и светового режима в клональном микроразмножении жимолости синей, малины и земляники позволил значительно увеличить КР и выход адаптированных микрорастений. Результаты этих исследований легли в основу усовершенствованных методик для клонального микроразмножения изучаемых культур.
Применение улучшенной методики увеличило выход адаптированных микрорастений жимолости синей в 3,8 раза, снизило их себестоимость – на 20,6 % (табл. 3). Это позволило в конечном итоге произвести стандартный посадочный материал с закрытой корневой системой в течение одного вегетационного периода при уровне рентабельности 113,0 %, что на 32,0 % выше, чем по традиционной методике. Соблюдение усовершенствованной методики клонального микроразмножения позволило увеличить выход адаптированных микрорастений малины красной в 7,1 раза, малины ремонтантной – в 3,3 раза. Уровень рентабельности составил соответственно
155 % и 145 %. Использование усовершенствованной методики увеличило выход микрорастений земляники садовой в 2,1 раза, ремонтантной – в 1,9 раза, снизило себестоимость одного адаптированного микрорастения соответственно на 33,0 % и 52,0 %, повысило уровень рентабельности до 80,7 и 134,4 % соответственно.
Выводы. Оптимальной питательной средой для жимолости синей на этапе введения в культуру in vitro оказалась 1/2 WPM, обеспечивающая выживаемость эксплантов 62,2 %. Питательная среда МС с пониженным на 15 % содержанием аммиачного азота, добавлением 6-БАП 1,0 мг/л + кинетин 0,5 мг/л при освещении СД-облучателем со спектром 2К:1С:1Б увеличивала КР до 5,1. Укореняемость микрочеренков жимолости синей на питательной среде МС мод. с добавлением ИМК 0,5 мг/л при освещении СД-облучателем 2К:1С:1Б достигала 89,0 %. Условия адаптации микрорастений жимолости синей в субстрате на основе верхового торфа с опрыскиванием 0,01 %-ным раствором НВ-101 обеспечили приживаемость жимолости синей до
93,4 %, при этом выход кондиционных адаптированных микрорастений составил 91,1 %.
На всех этапах микроразмножения in vitro малины оптимальной питательной средой была QL. Добавление в эту среду 6-БАП 1,0 мг/л + ГК 0,5 мг/л при облучении СД-облучателем 2К:1С:1Б обеспечило наибольший коэффициент размножения (5,3), а внесение ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 100мкл/л и освещение СД-облучателем 1К:1С:1Б – 100 %-ную укореняемость микрочеренков малины красной. Увеличить КР малины ремонтантной до 4,1 позволило добавление в среду QL 6-БАП 1,0 мг/л + ИМК 0,2 мг/л + ГК 0,5 мг/л и облучение СД 1К:1С:1Б, а внесение ИМК 0,5 мг/л + НВ-101 50мкл/л и облучение СД 2К:1С:1Б повысило укореняемость микрочеренков до 96 %.
Для культивирования in vitro земляники оптимальной питательной средой оказалась МС. При внесении в нее Силипланта и ЭкоФуса по 0,5 мл/л и освещении СД с меняющимся спектром отмечен максимальный в опыте коэффициент размножения микрочеренков земляники садовой (5,9), а использование НВ-101 в концентрации 100 мкл/л при освещении тем же фитооблучателем обеспечило самый высокий КР земляники ремонтантной (7,4). Добавление в среду МС НВ-101 в концентрации 100 мкл/л способствовало 100 %-ному укоренению микрочеренков земляники садовой при освещении СД-облучателем с меняющимся спектром, а земляники ремонтантной – при использовании мигающего СД-облучателя. Адаптация земляники в субстрате на основе верхового торфа с опрыскиванием 0,1 %-ным раствором Силипланта, 0,05 %-ным раствором Силипланта с ЭкоФусом и 0,4 %-ным раствором ПЖВМ при освещении СД-облучателем с меняющимся спектром обеспечила приживаемость 100 % микрорастений.
1. Kulikov IM, Minakov IA. [Development of gardening in Russia: trends, problems, prospects]. // Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka. 2017: 9-15 p.
2. Plaksina TV, Borodulina ID, Vorokhobova LS. Sovremennyi biotekhnologicheskii podkhod k proizvodstvu posadochnogo materiala sadovykh kul'tur. [Modern biotechnological approach to the production of planting material for horticultural crops]. Agrarnaya nauka - sel'skomu khozyaistvu: materialy XII Mezhdunarodnoi nauchno-prakticheskoi konferentsii. Barnaul: Altaiskii gosudarstvennyi agrarnyi universitet. 2017; 239-241 p.
3. Markova MG, Somova EN. [Influence of growth regulators and LED phyto-irradiators on the adaptation of garden strawberries]. Vestnik rossiiskoi sel'skokhozyaistvennoi nauki. 2019. (6): 12-15 p. doihttps://doi.org/10.30850/vrsn/2019/6/12-15.
4. Shipunova AA. Klonal'noe mikrorazmnozhenie plodovykh i dekorativnykh kul'tur v usloviyakh promyshlennogo proizvodstva. [Clonal micropropagation of fruit and ornamental crops in industrial production]. Biotekhnologiya kak instrument sokhraneniya raznoobraziya rastitel'nogo mira (fiziologo-biokhimicheskie, embriologicheskie, geneticheskie i pravovye aspekty): materialy VII Mezhdunar. nauchno-prakt. konf., posvyashch. 30-letiyu otdela biotekhnologii rastenii Nikitskogo botanicheskogo sada. Simferopol': Arial. 2016; 138-139 p.
5. Markova MG, Somova EN, Osokina AS. Pat. 2715695 RF. MPK Sposob ukoreneniya remontantnoi zemlyaniki v kul'ture in vitro. [Method of rooting remontant strawberries in culture in vitro]. Zayavleno 24.05.2019; opubl. 02.03.2020. Byul. № 7. 5 p.
6. Valeev RA, Yuran SI, Kondrat'eva NP. Pat. 127286 RF. MPK. Poleznaya model' “Svetodiodnaya sistema dlya oblucheniya meristemnykh rastenii”. [Utility model “LED system for irradiation of meristemic plants”]. // Zayavleno 17.07.2012; opubl. 27.04.2013 g. 5 p.
7. Mahlein AK, Oerke EC, Dehne HW. [Supplemental blue led lighting array to improve the signal quality in hyperspectral imaging of plants]. Sensors. 2015. 15 (6): 12834-12840 p.
8. Kondrat'eva NP, Il'yasov RI, Bol'shin RG. [The efficiency of the microprocessor system for automatic control of the operation of LED irradiation installations]. Sel'skokhozyaistvennye mashiny i tekhnologii. 2018. 3: 32-37 p.
9. Kolbanova EV. [Influence of phytohormones in the composition of the nutrient medium on the proliferation of regenerated plants of blue honeysuckle varieties (Lonicera caerulea L. var. Kamtschatica)]. Vestsі natsyyanal'nai akademіі navuk Belarusі. Seryya biyalagichnykh navuk. Mіnsk. 2020. 65 (1): 88-97 p. Doihttps://doi.org/10.29235/1029-8940-2020-56-1-88-97.
10. Subin A, Tkalenko G, Boroday V. Adaptation of regenerated strawberry plants to ex vitro using biological preparations. Agrobіologіya. 2016. 2 (128): 85-90 p.
11. Markova MG, Somova EN. [Use of waste products of larvae of the large wax moth in clonal micropropagation of garden strawberry]. Vestnik rossiiskoi sel'skokhozyaistvennoi nauki. 2020. (4): 66-68 p. doihttps://doi.org/10.30850/vrsn/2020/4/66-68.
