from 01.01.2014 until now
Tambov, Tambov, Russian Federation
National University of Science and Technology "MISIS" (Expert)
Tambov, Tambov, Russian Federation
Tambov, Russian Federation
National University of Science and Technology "MISIS" (Researcher)
Tambov, Tambov, Russian Federation
UDK 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
In this work, we studied the effect of graphene oxide on regenerants of downy birch when transferred to non-sterile greenhouse conditions (adaptation stage) during clonal micropropagation. During the experiment, it was found that a solution of graphene oxide at a concentration of 1.5 μg / l had a beneficial effect on the development of leaves and plant adaptability (+ 8%). However, with an increase in the concentration of nanomaterial to 3 μg / L, the survival rate decreased by 10% , the plant height - by 25%, and the number of adapted plants - by 35% relative to the control group. In addition, general condition of the seedlings of this group was assessed only by 3 points on a 5-point scale. The study of the content of graphene oxide in plant organs did not reveal pronounced foci of accumulation, which may indicate an indirect effect of nanomaterial on plants through changes in environmental conditions, for example, the availability of root nutrition or the composition of microbiota in the root zone. The mechanisms of ecological and biological impact of carbon nanomaterials on plants are not fully known and require further in-depth research
graphene oxide, biological effects, woody plantations, Bétula pubéscens, bioaccumulation
Введение
Производные графена широко используются в различных областях, включая накопление энергии, наноэлектронные устройства и батареи, биомедицинские приложения, биосенсоры, визуализацию клеток, доставку лекарств и тканевую инженерию [1-3]. Графеноподобные материалы могут служить «строительной платформой» для конструирования различных супрамолекулярных продуктов, которые имеют целый ряд потенциальных практических применений [4].
Оксид графена представляет собой соединение углерода, кислорода и водорода в различных соотношениях, полученное обработкой графита сильными окислителями. Обилие гидрофильных кислородосодержащих групп на поверхности делает его хорошо диспергируемым в полярных растворителях, в частности, в воде [5]. Это делает данный материал очень перспективным для медицинских и биотехнологических приложений, т.к., с одной стороны, гидрофильность чешуек оксида графена повышает его биодоступность, а с другой, наличие многочисленных =O, –OH и –COOH групп на поверхности облегчает функционализацию наноматериала биоактивными молекулами (антибиотиками, нуклеиновыми кислотами и т.д.).
Перспективным является использование оксида графена в сельском хозяйстве и биотехнологиях для стимуляции роста и защиты растений [6-8].
В то же время имеются работы, показывающие токсическое действие оксида графена по отношению к растениям. Так Рен с соавторами показали ингибирующее действие наноматериала в концентрации 500 мг/л на проростки кукурузы, сопровождаемое изменением концентрации Ca2+, продукцией АФК и перекисным окислением липидов [9]. При сравнении эффектов оксида графена и графена, модифицированного амином (G-NH2), было обнаружено, что в высоких концентрациях (500, 1000 и 2000 мг/л) оксид графена ингибировал процесс прорастания пшеницы и рост проростков, в то время как такие же дозы G-NH2 оказывали положительное воздействие. Под воздействием оксида графена увеличивалась потеря электролитов корнями, что свидетельствует о фитотоксичности этого типа наноматериала в высоких дозировках [10]. По данным Вочиты и коллег [11], прорастание семян пшеницы подавлялось высокой дозой оксида графена (2000 мг/л), и при этой концентрации также наблюдалось небольшое угнетение удлинения корня. Помимо этого, увеличение числа хромосомных аберраций и митотических аномалий указывает на генотоксические эффекты оксида графена в корневой меристеме пшеницы.
Несмотря на наличие работ по оценке влияния оксида графена на сельскохозяйственные растения, исследований, показывающих воздействие оксида графена на древесные культуры, играющие важную роль в наземных экосистемах, в открытом доступе не представлено, что обусловливает актуальность настоящего исследования. В представляемой работе показаны результаты исследования по оценке влияния оксида графена на проростки березы пушистой на этапе адаптации к нестерильным условиям теплицы.
Береза является популярным объектом для культивирования, т.к. находит широкое применение в лесовосстановлении и озеленении [12,13].
Материалы и методы
Получение и исследование наноматериала. Наночастицы оксида графена (GO) были получены методом Хаммерса [14], путем химической эксфолиации графита. Исследование наноматериала проводили с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния на Рамановском микроскопе Thermo DXR (Thermo Scientific, США) с лазером 532 нм при мощности 1 мВт через объектив 100х, сканирующей электронной микроскопии на микроскопе Vega3, Tescan (Чешская Республика) и атомно-силовой микроскопии на приборе AIST-NT (AIST-NT, Россия) в полуконтактном режиме с насадками NTMDT AFM.
Биологическое исследование. В работе использовались регенеранты березы пушистой, полученные путем клонального микроразмножения на этапе их адаптации к условиям теплицы. На этапах введения в культуру, мультипликации и укоренения использовали питательные среды, также содержащие оксид графена в различных концентрациях. Установлено негативное влияние наноматериала на проростки в дозе более 3 мкг/л, в то же время при 1,5 мкг/л отмечены положительные эффекты [15,16]. В связи с чем, на этапе адаптации растений были использованы концентрации наноматериала 1,5 и 3 мкг/л. В эксперименте использовали выровненные растения, имеющие 4-5 листьев и корневую систему длиной не менее 2 см. Проростки высаживали в технологические кассеты (объем ячейки - 155 мл.) наполненные увлажненным почвенным субстратом. Субстрат состоял из нейтрального торфа и перлита в соотношении 3:1. Растения культивировались в условиях парника в течение трёх недель при температуре 20-24 °С, 15-ти часовом фотопериоде, освещённости 4500 Люкс, относительной влажности воздуха 80-90 %. Для создания условий повышенной влажности в парнике применялась туманообразующая установка. Обработку проводили водными растворами оксида графена, полученными разведением исходной суспензии наноматериала дистиллирорванной водой до нужных концентраций. Обработку проводили в момент высадки и спустя 1,5 недели, путем введения препаратов под корень (100 мл раствора на ячейку). В качестве контролей использовались дистиллированная вода и ростовой стимулятор 2,4-эпибрассинолид, выпускаемый под коммерческим названием «Эпин» (Россия). В ходе исследования проводили учет следующих показателей: количество выживших растений, количество растений адаптированных к нестерильным условиям, морфометрические параметры побегов (высота растений, число листьев, число увядших листьев, количество дополнительных побегов, состояние по пятибалльной шкале).
Эксперимент проводился в 3-ёх кратной повторности, количество растений в каждой из 4-ёх групп («Контроль», «Эпин», «GO 1 мкг/л» и «GO 3 мкг/л») составляло 30, выборки имели независимый характер. Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программы Microsoft Excel 2010 (пакет «Описательная статистика») с применением однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), достоверность различий вычислялась с помощью F-критерия Фишера при 5%-ном уровне значимости.
Анализ накопления оксида графена в растениях. Анализ нанкопления и распределения оксида графена в тканях экспериментальных растений осуществлялся на сканирующих электронных микроскопах Neon 40 и Merlin (Carl Zeiss, Германия) с элементным анализом. Для проведения исследования навеску растительной ткани массой 250 мг растирали в охлажденной ступке в 0,5 мл дистиллированной воды. Полученный гомогенат наносили на подложку и высушивали при комнатной температуре.
Результаты и обсуждение
Результаты анализа образца оксида графена. Исследование методом рамановской спектроскопии подтвердило принадлежность полученного материала к оксиду графена – были зафиксированы основные линии характерные для данного наноматериала D (1338 см-1) и G (1590 см-1) [17-19]. Методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что образец имеет пластинчатую структуру без каких-либо других видов частиц кристаллизованной фазы. Анализ образца методом атомно-силовой микроскопии показал, что поперечный размер чешуек варьируется от 0,1 до 3 мкм, в то время как их средняя толщина менее 1 нм. Таким образом, анализ полученного образца оксида графена показал, что материал имеет характерную пластинчатую морфологию с размером отдельных чешуек от 0,1 до 3 мкм и толщиной менее 1 нм.
Влияние оксида графена на проростки березы пушистой. Результаты исследования влияния оксида графена на проростки березы пушистой показали, что оксид графена в концентрации 1,5 мкг/л не оказал достоверного влияния на выживаемость растений, однако при повышении концентрации до 3 мкг/л показатель уменьшался до 10% относительно контроля (Рис. 1). Максимальный показатель выживаемости наблюдался при обработке растений стимулятором роста - +5%.
Максимальная высота растений наблюдалась в группе обработанной Эпином – 4,4 см, против 4 см в контроле. При 1,5 мкг/л оксида графена значения высоты побегов были на уровне контрольных, а при 3 мгк/л показатель уменьшился на 25% и составил в среднем 3 см (Рис. 2).
Внесение оксида графена в концентрации 1,5 мкг/л благоприятно сказалось на развитии листьев. В этом варианте увеличилось среднее количество листьев на одном растении (+1), а также изменилось соотношение нормальных листьев к увядшим (Рис. 3). На 6 развившихся листьев отмечалось 3 увядших, в то время как в контроле из 5 листьев увядало 4. Худшие показатели зафиксированы в варианте 3 мкг/л оксида графена – на 4 листа, 4 увядших.
Рисунок 1. Влияние оксида графена на выживаемость регенерантов березы пушистой
Figure 1. Effect of graphene oxide on the survival rate of downy birch regenerated
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
Рисунок 2. Влияние оксида графена на рост регенерантов березы пушистой
Figure 2. Effect of graphene oxide on the growth of downy birch regenerants
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
При оценке адапрированности растений к нестерильным условиям также установлено положительное влияние оксида графена в дозе 1,5 мкг/л. Число адаптированных растений составило 60% (на уровне регулятора роста) при 52% в контрольном варианте (Рис. 4). При повышении концентрации наноматериала число адаптированных растений снизилось на 35%.
Рисунок 3. Состояние вегетативных органов регенерантов березы пушистой
Figure 3. The state of the vegetative organs of the downy birch regenerated
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
Рисунок 4. Эффективность адаптации регенерантов березы пушистой
Figure 4. The efficiency of adaptation of downy birch regenerated
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
Наилучшее состояние растений было в группе, культивируемой с применением стимулятора, худшее состояние отмечено в варианте 3 мкг/л оксида графена. (Табл. 1). Дополнительных побегов не образовалось ни в одном из вариантов.
Таблица 1
Показатели эффективности адаптации побегов березы пушистой
Table 1
Indicators of adaptation efficiency of downy birch shoots
|
Вариант | Varaint |
Число дополнительных побегов, шт. Number of extra shoots, pcs. |
Состояние микроклонов по 5-ти бальной шкале | Condition of microclones on a 5-point scale |
|
Контроль | Control |
0 |
4 |
|
Эпин | Epin |
0 |
5 |
|
GO 1,5 мкг/л | GO 1.5 μg/L |
0 |
4 |
|
GO 3 мкг/л | GO 3 μg/L |
0 |
3 |
Источник: собственные вычисления автор(ов)
Source: own calculations
Таким образом, в ходе эксперимента показано, что раствор оксида графена с концентрацией 1,5 мкг/л оказывал благоприятное влияние на появление листьев и на адаптируемость растений (+8%). Однако при повышении концентрации наноматериала до 3 мкг/л выживаемость снизилась на 10% относительно контроля, высота растений на 25%, а число адаптированных растений на 35%. Кроме того, общее состояние проростков данной группы оценивалось только на 3 балла. Разнонаправленное действие оксида графена показано и другими авторами. Например, Наир и др. [20] показали, что проростки риса, проросшие в присутствии графена, показали лучшую жизнеспособность и рост по сравнению с необработанными проростками. Точно так же всхожесть семян томатов увеличивалась порошкообразным графеном, возможно, из-за способности графена улучшать поглощение воды через кожуру семян [21]. С другой стороны, в нескольких исследованиях сообщалось, что прорастание семян задерживалось или подавлялось нанесением графена или оксида графена [22]. В другом краткосрочном исследовании графен способствовал значительному удлинению корня, но ингибировал развитие корневых волосков, что может быть связано с индуцированным графеном окислительным стрессом в корнях проростков пшеницы [23].
Анализ накопления оксида графена в растениях. Для электронно-микроскопического исследования были взяты растения, обработанные раствором оксида графена в концентрации 3 мкг/л, а также растения контрольной группы.
Анализ накопления частиц оксида графена в корнях растений березы не выявил частиц наноматериала (Рис. 5).
Рисунок 5. Микрофотографии корня березы: а) контроль, б) группа 3 мкг/л
Figure 5. Micrographs of the birch root: a) control, b) group 3 μg/L
Источник: собственное исследование автор(ов)
Source: author’s study
Электронно-микроскопическое исследование накопления оксида графена в стеблях березы также показало отсутствие наночастиц (Рис. 6).
Для подтверждения результатов электронно-микроскопического исследования бионакопления и более детального анализа содержания углерода в тканях растений было проведено картирование элемента (Рис. 7).
Рисунок 6. Микрофотографии стебля березы пушистой: а) контроль, б) группа 3 мкг/л
Figure 6. Micrographs of the birch stem: a) control, b) group 3 μ/L
Источник: собственное исследование автор(ов)
Source: author’s study
Рисунок 7. Распределение углерода в тканях корня и стебля березы пушистой: а) корень растений контрольной группы в) стебель растений контрольной группы, б) корень растений группы 3 мкг/л, г) стебель растений группы 3 мкг/л
Figure 7. Distribution of carbon in the tissues of the downy birch root and stem: a) the root of the plants in the control group, c) the stem of the plants in the control group, b) the root of the plants in the 3 μg/L group, d) the stem of the plants in the 3 μg/L group
Источник: собственное исследование автор(ов)
Source: author’s study
Как видно из представленных микрофотографий, во всех случаях углерод характеризовался равномерным распределением по образцу, независимо от обработки растений оксидом графена.
Таким образом, наше исследование показало отсутствие биоаккумуляции оксида графена в побегах березы пушистой. Стоит сказать, что другими авторами показано проникновение наноматериала в растения, например, в проростки гороха [24,25] или шелуху семян томата [21]. Можно предположить, что отмеченные различия связаны с разным размером чешуек и используемыми концентрациями оксида графена, а также с видовыми особенностями растений.
Выводы (Заключение)
Таким образом, в ходе эксперимента установлено разнонаправленное действие оксида графена на регенеранты березы пушистой. При обработке побегов раствором наноматериала с концентрацией 1,5 мкг/л отмечено благоприятное влияние на развитие листьев и адаптируемость растений. В то же время при повышении концентрации вещества до 3 мкг/л снижалась выживаемость и высота побегов, а также число адапрированных растений. С учетом того, что методом электронной микроскопии не зафиксировано бионакопления наночастиц можно говорить, что отмеченные эффекты не связаны с проникновением наноматериала в ткани растений. Например, группа ученых [26] установила, что графеновые квантовые точки (GQD) могут способствовать поглощению воды и питательных веществ за счет увеличения эффективных площадей поверхности эпидермальных (ризодермальных) клеток корня. Разработанная ими схематическая модель показывает, что GQD непосредственно прикрепляются к поверхности клеток корня растений, увеличивая область поглощения ионов на поверхности корня.
Среди возможных механизмов токсического действия оксида графена, не связанных с его проникновение в ткани растений, можно выделить непрямое воздействие через изменение окружающей среды – например, доступности корневого питания или состава микробиоты в прикорневой зоне.
Проведенное исследование, а также результаты работ других авторов свидетельствуют о том, что механизмы воздействия оксида графена на растения требуют дальнейшего изучения. Результаты нашей работы могут быть использованы в биотехнологии клонального микроразмножения растений при переведении их из стерильный лабораторных условий в грунт
1. Ou L., Song B., Liang H., Liu J., Feng X., Deng B., Sun T., Shao L. Toxicity of graphene-family nanoparticles: a general review of the origins and mechanisms. Particle and Fibre Toxicology. 2016;13:57. DOIhttps://doi.org/10.1186/s12989-016-0168-y
2. Sun Y., Sun M., Xie D. Graphene Electronic Devices. Graphene. Fabrication, haracterizations, Properties and Applications. 2018;103. DOIhttps://doi.org/10.1016/B978-0-12-812651-6.00005-7
3. Ye M., Zhang Zh., Zhao Y., Qu L. Graphene Platforms for Smart Energy Generation and Storage. Joule. 2018;2(2):245-268. DOIhttps://doi.org/10.1016/j.joule.2017.11.011
4. Zhou J., Chen M., Diao G. Calix[4,6,8]arenesulfonates functionalized reduced graphene oxide with high supramolecular recognition capability: Fabrication and application for enhanced host-guest electrochemical recognition. ACS Applied Materials Interfaces. 2013;5: 828-836. DOIhttps://doi.org/10.1021/am302289v
5. Dreyer D.R., Park S., Bielawski C.W., Ruoff R.S. The chemistry of graphene oxide. Chemical Society Reviews. 2010;39(1):228-240. DOIhttps://doi.org/10.1039/B917103G
6. Park S., Choi K.S., Kim S., Gwon Y., Kim J. Graphene Oxide-Assisted Promotion of Plant Growthand Stability. Nanomaterials. 2020;10:758. DOIhttps://doi.org/10.3390/nano10040758
7. Kabiri Sh., Degryse F., Tran D.N.H., da Silva R.C., McLaughlin M.J., Losic D. Graphene Oxide: A New Carrier for Slow Release of Plant Micronutrients. ACS Applied Materials Interfaces. 2017;9(49):43325-43335. DOIhttps://doi.org/10.1021/acsami.7b07890
8. Wang X., Xie H., Wang Zh., Hea K., Jing D. Graphene oxide as a multifunctional synergist of insecticides against lepidopteran insect. Environmental Science: Nano. 2019;6:75-84. DOIhttps://doi.org/10.1039/C8EN00902C
9. Ren W., Chang H., Teng Y. Sulfonated graphene-induced hormesis is mediated through oxidative stress in the roots of maize seedlings. Science of the Total Environment. 2016;572:926-934. DOIhttps://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2016.07.214
10. Chen J., Yang L., Li S., Ding W. Various Physiological Response to Graphene Oxide and Amine-Functionalized Graphene Oxide in Wheat (Triticum aestivum). Molecules. 2018;23:1104. DOIhttps://doi.org/10.3390/molecules23051104
11. Vochita G., Opric L., Gherghel D., Mihai C.-T., Boukherrou R., Lobiu A. Graphene oxide effects in early ontogenetic stages of Triticum aestivum L. seedlings. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2019;181:345-352. DOIhttps://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2019.06.026
12. Popov V.K., Tabackaya T.M., Sivolapov A I. Regeneranty berezy i topolya, poluchennye in vitro v plantacionnyh kul'turah pod Voronezhem. Biotehnologiya v FCP "Integraciya":Tez. dokl. 1999:36-37.
13. Shapkin O.M., Pogiba S.P., Kazanceva E.V. Populyacionno-geneticheskiy analiz karel'skoy berezy i vegetativnoe razmnozhenie ee cennyh form. Lesohoz. inform /VNIIClesresurs. 1996;9: 4 -15.
14. Hummers W.S., Offeman R.E. Preparation of graphitic oxide. Journal of the American Chemical Society. 1958;1339. DOIhttps://doi.org/10.1021/ja01539a017.
15. Zakharova O., Kolesnikova E., Muratov D.S., Il'inikh I., Tsukanova E., Yevtushenko N., Strekalova N., Gusev A. Effects of graphene oxide on white poplar x aspen (Populus alba h Populus tremula) hybrid microsprouts at various growth stages. IOP Conf. Series: Materials Science and Engineering. 2019;693:012037. DOIhttps://doi.org/10.1088/1757-899X/693/1/012037
16. Zakharova O., Kolesnikova E., Muratov D., Gusev A. Stimulating and toxic effects of graphene oxide on Betula pubescens microclones. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2020;595:012010 DOIhttps://doi.org/10.1088/1755-1315/595/1/012010
17. Muzyka R., Drewniak S., Pustelny T., Chrubasik M., Gryglewicz G. Characterization of Graphite Oxide and Reduced Graphene Oxide Obtained from Different Graphite Precursors and Oxidized by Different Methods Using Raman Spectroscopy. Materials. 2018;11(7):1050. DOIhttps://doi.org/10.3390/ma11071050.
18. Oh W-Ch., Zhang F-J. Preparation and characterization of graphene oxide reduced from a mild chemical method. Asian Journal of Chemistry. 2011;23(2):875-879.
19. 27. Rattana, Chaiyakun S., Wititanun N., Nuntawong N., Chindaudom P., Oaew S., Kedkeaw C., Limsuwan P. Preparation and characterization of graphene oxide nanosheets. Procedia Engineering. 2012;32:759-764. DOIhttps://doi.org/10.1016/j.proeng.2012.02.009
20. Nair R., Mohamed M.S., Gao W., Maekawa T., Yoshida Y., Ajayan P.M., Kumar D.S. Effect of carbon nanomaterials on the germination and growth of rice plants. Journal of nanoscience and nanotechnology. 2012;12:2212-2220. DOIhttps://doi.org/10.1166/jnn.2012.5775
21. Zhang M., Gao B., Chen J., Li Y. Effects of graphene on seed germination and seedling growth. Journal of Nanoparticle Research. 2015;17:78. DOIhttps://doi.org/10.1007/s11051-015-2885-9
22. Liu S., Wei H., Li Z., Li S., Yan H., He Y., Tian Z. Effects of graphene on germination and seedling morphology in rice. Journal of nanoscience and nanotechnology. 2015;15:2695-2701. DOIhttps://doi.org/10.1166/jnn.2015.9254
23. Zhang P., Zhang R.,Fang X., Song T., Cai X., Liu H., Du S. Toxic effects of graphene on the growth and nutritional levels of wheat (Triticum aestivum L.): Short-and longterm exposure studies. Journal of hazardous materials. 2016;317:543-551. DOIhttps://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2016.06.019
24. Chen L., Wang C., Yang S., Guan X., Zhang Q., Shi M., Yang S.T., Chen C., Chang X.L. Chemical reduction of graphene enhances in vivo translocation and photosynthetic inhibition in pea plants. Environmental science. Nano. 2019;6:1077-1088. DOIhttps://doi.org/10.1039/C8EN01426D
25. Park S., Kim T., Gwon Y., Kim S., Kim D., Park H.H., Lim K.T., Jeong H.E., Kim K., Kim J. Graphene-Layered Eggshell Membrane as a Flexible and Functional Scaffold for Enhanced Proliferation and Differentiation of Stem Cells. ACS Applied Bio Materials. 2019;2:4242-4248. DOIhttps://doi.org/10.1021/acsabm.9b00525
26. Xu Y., Lu Y., Li J., Liu R., Zhu X. Effect of graphene quantum dot size on plant growth. Nanoscale. 2020;12:15045-15049. DOIhttps://doi.org/10.1039/D0NR01913E
