Эпидемиологические данные за последнее десятилетие демонстрируют последовательное снижение показателей заболеваемости, распространенности туберкулеза (ТБ) и смертности от него в нашей стране, однако проблема лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis (МБТ), а именно множественной резистентности, признана ВОЗ глобальной угрозой (Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance, 2006). Основой послужило то, что в последние годы причиной смерти больных ТБ в 98% случаев являются мультирезистентные штаммы [18, 19, 22, 24, 34].
МБТ относятся к кислотоустойчивым патогенным микобактериям с достаточно широким спектром изменчивости морфологических, культуральных и биологических особенностей. Особый интерес представляет резистентность бактериальной клетки к лекарственному антибактериальному агенту, обеспечивающаяся возникновением такой формы изменчивости, как лекарственная устойчивость. Исследования на молекулярном уровне позволили раскрыть некоторые механизмы ее развития к противотуберкулезным препаратам. Установлено, что резистентность обусловлена одной или несколькими хромосомными мутациями в независимых генах МБТ. Так, например, устойчивость к рифампицину и изониазиду обусловлена мутациями в генах rpoB, katG, inhA и ahpC [7]. После возникновения селекции лекарственно-устойчивых штаммов, они могут передаваться воздушно-капельным путем от больного к здоровому человеку [11]. Наряду с этим высказывается предположение о том, что ослабление иммунной системы организма может служить одним из факторов развития лекарственно-устойчивого ТБ при микст-инфекции штаммами МБТ с различающейся чувствительностью к лекарственной терапии с последующим отбором в ходе эволюции инфекционного процесса и на фоне лечения наиболее агрессивных вариантов возбудителя, устойчивых к действию лекарственных средств и факторов противоинфекционной защиты. Установлено также, что у больных ТБ, выделяющих лекарственно-устойчивые МБТ, нарушения индуктивной и эффекторной стадий иммунного ответа носят более выраженный характер, чем у больных, выделяющих чувствительные к противотуберкулезным препаратам МБТ, и усугубляются по мере расширения спектра лекарственной бактериорезистентности. Однако молекулярные механизмы этого феномена до настоящего времени остаются неизученными [17].
Лекарственная устойчивость может быть первичной при выделении устойчивого штамма у ранее не леченного больного и вторичной, приобретенной в процессе химиотерапии. Лекарственная устойчивость описана по отношению ко всем известным специфическим в отношении ТБ препаратам и их сочетаниям [14]. Первичную и вторичную лекарственную устойчивость МБТ по спектру разделяют на монорезистентность – устойчивость к одному из противотуберкулезных препаратов основного (первого) ряда, полирезистентность – устойчивость к двум и более базовым препаратам, но не к рифампицину и изониазиду одновременно, и мультирезистентность или множественную устойчивость МБТ одновременно к изониазиду, рифампицину и любому другому противотуберкулезному препарату. В настоящее время выделяют еще один тип устойчивости – широкую лекарственную устойчивость, характеризующуюся резистентностью МБТ к препаратам первой линии (изониазиду и рифампицину), любым фторхинолонам и, по крайней мере, к одному из трех инъекционных препаратов второй линии (амикацину, канамицину или капреомицину). Данный вариант является наиболее неблагоприятным. В 2013 г. в мире у 9,0% больных ТБ диагностировали широкую лекарственную устойчивость МБТ (в 2010 г. –5,4%) [28].
Широкая лекарственная устойчивость формируется на фоне прерванного или безуспешного лечения больных ТБ с множественной лекарственной устойчивостью. Среди больных ТБ с широкой лекарственной устойчивостью отмечается высокая летальность: более 48% больных умерли в течение трехлетнего срока наблюдения с момента регистрации данной формы ТБ [4].
Для оценки биологических свойств мультирезистентных штаммов МБТ используется метод количественной оценки вирулентности по числу колониеобразующих единиц. Выявлено, что у отдельных устойчивых изолятов МБТ отмечен более низкий уровень накопления их в органах по сравнению с чувствительными штаммами. Некоторые резистентные изоляты практически не отличаются от вирулентных чувствительных штаммов и обладают выраженной пневмотропностью, что указывает на их эпидемическую опасность. Отсюда вывод, что биологическая активность лекарственно-устойчивых МБТ по сравнению с их чувствительными видами, характеризуется более массивным ростом при более медленной скорости роста на плотных питательных средах. По своей вирулентности они не уступают чувствительным штаммам МБТ [12].
Благодаря многочисленным исследованиям в области микробиологии, касающихся генотипирования и дифференцировки МБТ на уровне хромосомной ДНК, удалось определить, что среди микобактерий, выделяемых больными ТБ, преобладают штаммы генетического семейства Beijing. Вирулентность этого штамма, циркулирующего в Северо-Западном регионе России, выше вирулентности штаммов того же генотипа, встречающихся в Бразилии. Существует предрасположенность к туберкулезным процессам, вызванным МБТ семейства Beijing у больных – носителей С-аллеля рецепторов к IL-1 [12]. Такие МБТ характеризуются способностью вызывать тяжелые, трудно поддающиеся лечению случаи ТБ легких с высоким уровнем смертности, в том числе и благодаря наличию возможности обойти иммунологическую защиту организма, сформированную вакциной БЦЖ. Установлено, что конкретно для этого штамма характерна повышенная изменчивость и ассоциированность с мультирезистентностью [5, 13].
Из данной информации можно сделать вывод, что резкое утяжеление структуры лекарственной устойчивости за счет роста мультирезистентности и широкой лекарственной устойчивости объясняется обширной циркуляцией на территории России штаммов M. tuberculosis генетического семейства Beijing. Вызванную таким патогеном туберкулезную инфекцию отличает тяжелое течение с исходом в хроническую рецидивирующую форму, плохо поддающуюся противотуберкулезной химиотерапии и требующую применения хирургических методов лечения.
Что касается морфологии микотуберкулезного воспаления, то она самым тесным образом связана с состоянием иммунной системы организма больного и в значительной степени определяется ею. Но нельзя также забывать и о биологических свойствах возбудителя – МБТ вызывает в организме сложное многообразие иммунных клеточных реакций, к числу которых относится выраженная клеточная гиперчувствительность. Каждый из этапов этого инфекционного процесса характеризуется определенными тканевыми и клеточными реакциями, сдвигами в обменных процессах и функциональном состоянии клеток [21, 31].
Антигенпрезентирующие клетки, а именно альвеолярные макрофаги/моноциты и дендритные клетки, являясь представителями естественной иммунологический резистентности, оказывают решающее влияние на формирование антимикобактериального иммунитета. Они обеспечивают первый этап иммунного ответа: связывание, поглощение и расщепление инфектогена, его презентацию Т-лимфоцитам и синтез цитокинов, активирующих Т-клеточное звено иммунитета [17, 27].
Эффективный ответ Т-клеток приводит к снижению риска развития активного туберкулезного процесса на протяжении всей жизни [23]. Согласно данным, используя истощение антител и Т-клеточный перенос у различных мышей с дефицитом Т-клеток, можно сделать вывод, что у мышей активация CD4+ или CD8+ Т-клеток важна для поддержания низкой бактериальной нагрузки в тканях. У людей важность ответа CD4+ Т-клеток подтверждается резко повышенным риском развития активного туберкулеза с ко-инфекцией вируса иммунодефицита человека, который снижает количество CD4+ Т-клеток у пациентов. Обильные косвенные данные также подтверждают, что эффекторные функции человеческих CD8+ Т-клеток способны подавлять рост микобактерий, хотя активационные элементы для различных популяций CD8+ Т-клеток остаются неуловимыми. Таким образом, терапевтические и вакцинные стратегии, направленные на развитие защитных реакций Т-клеток, были бы полезны для минимизации курса лечения антибиотиками, предотвращения распространения резистентного к лекарственным средствам ТБ и уменьшения снижения воспалительных реакций и травм легких [12, 33].
Реакция легочной ткани на внедрение МБТ определяется характером инфицирования – первичным (экзогенным) или вторичным (эндогенным), развивающимся под воздействием неблагоприятных факторов на фоне предварительного инфицирования в прошлом, с быстрым формированием реакции гиперчувствительности замедленного типа, определяющей образование специфических гранулем [15, 17]. Как при любых других гранулемах, воспаление начинается с различной степени повреждения ткани вплоть до некроза, в дальнейшем к очагу повреждения мигрируют нейтрофилы, служащие первой линией защиты, а вскоре вслед за ними появляются мононуклеарные клетки – активные макрофаги и дендритные клетки. Нейтрофилы гибнут из-за слабого для МБТ бактерицидного потенциала, с развитием местной неспецифической воспалительной реакции, нарушением микроциркуляции, экссудацией плазмы. В дальнейшем, будучи недостаточно эффективными в борьбе с МБТ, нейтрофилы располагаются в небольшом количестве по периферии гранулемы и играют важную роль в фагоцитозе более мелких субклеточных элементов, а макрофаги, обладая большой фагоцитарной активностью, сдерживают размножение бактерий, что постепенно ведет к нарастанию клеточного иммунитета. Однако микобактерии способны блокировать секреторную реакцию альвеолярных макрофагов, тормозить слияние лизосомы с фагосомой, тем самым обусловливая незавершенный фагоцитоз МБТ и формирование многослойных мембран, которые препятствуют контакту с бактерицидными веществами [2, 15, 19, 21].
Внутрисосудистые и интерстициальные макрофаги различаются по местоположению и функции от альвеолярных макрофагов. Предполагают, что интерстициальные макрофаги функционируют в регуляции фиброза ткани, воспаления и представления антигена, тогда как внутрисосудистые макрофаги «рекрутируют» нейтрофилы или миелоидные клетки [30].
Что касается дендритных клеток, их роль заключается не только в фагоцитировании МБТ. Благодаря тому, что на клеточной мембране дендритных клеток локализуются гликопротеиды главного комплекса гистосовместимости (HLA), Т-лимфоциты, реагирующие на чужеродные антигены только в комплексе с антигенами HLA, контактируя с инфицированными дендритными клетками дифференцируются на субпопуляции. Затем происходит активация цитотоксических Т-лимфоцитов, взаимодействие Т-лимфоцитов и макрофагов, стимуляция В-клеток и макрофагов к уничтожению МБТ [26, 29].
В региональных лимфатических узлах происходит активация Т-клеток, зависящая от состава цитокинов и количества МБТ. С участием IL-12 и γ-интерферона (IFNγ) образуются Т-хелперы 1 типа (Th-1), которые, в свою очередь, секретируют IL-2, способствующий созреванию Th1 и цитотоксических CD8-лимфоцитов (выделяют перфорин, гранулизин для уничтожения инфицированных МБТ клеток) и IFNγ, который активирует альвеолярные макрофаги, а они затем – производство свободных радикалов и оксида азота для уничтожения МБТ, а также выделение фактора некроза опухоли альфа (TNFα). TNFα, продуцируемый активированными альвеолярными макрофагами, натуральными киллерными клетками и CD4+ лимфоцитами, стимулирует секрецию IL-8, который привлекает новые моноциты и лимфоциты к МБТ, способствует апоптозу инфицированных МБТ макрофагов, а также участвует в формировании специфической гранулемы. Именно фагоцитоз апоптотических телец (содержащих МБТ) соседними здоровыми макрофагами приводит к уничтожению МБТ [2, 9, 15, 20, 27, 35].
Таким образом, в лимфатическом узле дендритные клетки презентируют антигены МБТ Т-лимфоцитам, вследствие чего происходит дифференцирование сенсибилизированных (чувствительных к МБТ) CD4+ (хелперных) и CD8+ (цитотоксических) лимфоцитов, способствующих формированию гранулемы, и обеспечивают координацию различных клеток иммунной системы в подавлении инфекции [20, 23, 29].
Сенсибилизированные Т-лимфоциты и активированные альвеолярные макрофаги (с содержащимися в них МБТ) лимфогенным или гематогенным путем возвращаются в легкие, где формируются специфические гранулемы, где при длительной стимуляции МБТ активированные макрофаги могут превращаться в эпителиоидные клетки, которые секретируют фактор активации фибробластов, а затем сливаются и образовывают гигантские клетки Пирогова-Лангханса. В связи с высвобождением лизосомальных гидролаз из разрушенных макрофагов, в центре гранулемы возникают дистрофические и некробиотические изменения, которые представлены казеозным некрозом. За счет увеличения зоны центрального некроза истончается воспалительно-клеточный вал, что свидетельствует о прогрессировании процесса с разрушением ткани. По периферии гранулемы накапливаются фибробласты, вырабатывающие коллаген с образованием фиброзной капсулы [2, 15, 21].
Клеточный состав туберкулезной гранулемы находится в состоянии динамики и меняется на разных стадиях их образования и инволюции. На высоте гранулематозной реакции преобладают Т-клетки, хотя присутствуют также и В-клетки, множество макрофагов, осуществляющих активную фагоцитарную функцию.
Некоторые зарубежные ученые на основе молекулярно-клеточных исследований пришли к выводу, что трансформация макрофагов в эпителиальные клетки происходит за счет так называемой Е-кадгерин-зависимой мезенхимально-эпителиальной трансформации (МЭТ). Е-кадгерин (СD324) – белок, регулирующий межклеточную адгезию и пролиферацию эпителиальных клеток. Нарушение этих белково-опосредованных связей приводит к дезорганизации классической гранулемы, т.е. к увеличению доступа для иммунных клеток и снижению бактериальной нагрузки. Исследователи пришли к выводу, что гранулема служит в первую очередь защитой бактерий от организма хозяина. При микобактериальной инфекции макрофагальная гранулема также запрограммирована МЭТ и именно это влияет на течение инфекции и связанный с ней иммунный ответ [25].
Говоря о роли и морфологии сосудистого русла ткани легких, стоит сказать, что поражение эндотелия является важным звеном в патогенезе микобактериальной инфекции. Эндотелий служит барьером между кровью и тканями, участвует в процессах воспаления, проявляет антиагрегантные свойства, регулирует тонус сосудов, участвует в пролиферативных процессах гладкомышечных клеток. С повреждением эндотелиальных клеток уменьшается их способность высвобождать NO и эндотелиальные релаксирующие факторы, тогда как образование вазоконстрикторных факторов, напротив, увеличивается, снижается барьерная функция эндотелия и повышается его проницаемость для провоспалительных цитокинов, снижается его противомикробная активность за счет ингибирования воздействия на МБТ радикалов О2 и оксида азота. В микроциркуляторном русле легких происходит транскапиллярный переход белков плазмы в паренхиму органа с развитием иммунопатологических процессов в нем за счет персистенции иммунных комплексов и дисбаланса цитокинов с макрофагальной дисфункцией и нарушением межклеточных взаимоотношений [3, 6, 10, 36].
В респираторном отделе легких морфологические изменения обусловлены высокой капиллярной и клеточной проницаемостью. В ответ на повреждающее действие МБТ повышается проницаемость микроциркуляторного русла, усиливается транскапиллярный переход жидкости и находящихся в ней веществ, а также клеточных элементов крови (нейтрофильные лейкоциты, лимфоциты, моноциты) из кровеносных сосудов в интерстициальную ткань. В альвеолярном эпителии – альвеолоцитах I и II типов, нарушение микроциркуляции жидкости ведет к возникновению внутриклеточного и интерстициального отека, набуханию клеток и их ультраструктурных элементов [6, 10].
Клетки I типа являются тонкими, плоскими и покрывают 93-97% альвеолярной поверхности, что обеспечивает эффективный газообмен. Эпителиальные клетки II типа являются кубическими, с апикальными микроворсинками и цитоплазматическими пластинчатыми телами. Они продуцируют и секретируют липиды и белки легочного сурфактанта, а также другие растворимые компоненты врожденной иммунной системы. Эти вещества обладают широко распространенной иммунной активностью, действуют как опсонины и/или микробные агрегирующие агенты, передающие сигналы молекулам, которые формируют иммунные клеточные фенотипы и микробициды, разрушающие или дестабилизирующие стенки микробных клеток [30].
Согласно недавним исследованиям зарубежных ученых, альвеолоциты II типа определяют как клеточный резервуар для МБТ, способный ускорять рост бактерий, в то же время потенциально избегая распознавания фагоцитами в альвеолах. Ускоренный внутриклеточный рост МБТ и высвобождение медиаторов воспаления альвеолоцитов могут приводить к повышенной восприимчивости к хозяину. Вероятно, что неспособность альвеолоцитов II типа эффективно проводить единовременный киллинг МБТ внутри цитозоля может способствовать дальнейшему росту вследствие некроза альвеолоцитов, что позволяет МБТ инфицировать соседние клетки. В качестве альтернативы, эти клетки могут потенциально действовать как убежище для МБТ во время установления инфекции, способствуя медленной, но устойчивой репликации, уклонению от обнаружения с помощью фагоцитов и минимизации агрессивного воспалительного ответа и повреждения тканей. Это может позволить МБТ адаптироваться, ограничивая его метаболизм и рост до реактивации латентной инфекции и перехода в активное заболевание. Наконец, альвеолоциты могут способствовать распространению инфекции путем обеспечения доступа МБТ к интерстициальному пространству через апикальную поверхность. В этом отношении МБТ может взаимодействовать с интерстициальными дендритными клетками, которые затем мигрируют в лимфатические узлы для стимуляции адаптивного иммунного ответа.
Эти данные базируются на экспериментах, проведенных как in vitro, так и in vivo: исследования с использованием клеточных линий показали рост МБТ, распространяющийся по всему эпителию от инфицированных некротических клеток на соседние клетки. Эксперименты in vivo демонстрируют ранний рост МБТ внутри альвеолоцитов II типа, а доказательства способности МБТ к репликации подтверждаются выделением бактериальной ДНК из альвеолярного эпителия у умерших, инфицированных МБТ индивидуумов. Кроме того, ДНК МБТ была обнаружена в эпителиальной ткани легкого, не связанной с гранулемами [32].
Механизм повреждения эндотелия микроциркуляторного русла и выхода клеток крови в периваскулярную соединительную ткань начинается со скапливания нейтрофильных лейкоцитов на внутренней поверхности капиллярной стенки. Воздействуя своими протеолитическими ферментами, они вызывают повреждение эндотелия, а также его базальной мембраны. Взаимодействие нейтрофильных лейкоцитов и эндотелиальных клеток вызывает цепь последовательных реакций, результатом которых является структурная перестройка эндотелиальных клеток – сокращение и повышение капиллярной проницаемости.
На начальном этапе воспаления, повышение клеточной и капиллярной проницаемости приводит к гидратации альвеолоцитов II типа, ответственных за синтез и секрецию сурфактанта. На более поздних этапах происходит развитие внутриальвеолярного отека с разрушением и инактивацией альвеолярного сурфактанта. Отсюда и возникает недостаточность сурфактантной системы, приводящая к развитию ателектазов, что только способствует прогрессированию туберкулезного процесса. Происходит разрушение клеток аэрогематического барьера, набухание основного вещества и разрыхление волокнистых структур соединительной ткани интерстиция, что уменьшает прочность респираторного отдела и усугубляет специфический процесс [6].
Во время формирования иммунной туберкулезной гранулемы, структурные и функциональные нарушения легочной паренхимы нарастают, а нарушения в микроциркуляторном русле приобретают глубокий и распространенный характер.
Наряду с этим, на фоне преобладания экссудативного характера воспаления с поражением микрогемоциркуляторного русла легких, становится возможным значительное отложение фибрина в зоне воспаления. Поражение эндотелия сосудов приводит к активации и адгезии тромбоцитов и способствует выделению тканевого тромбопластина, играющего роль катализатора по отношению к начинающимся процессам локального выделения и свертывания фибрина. В патогенезе выпадения фибрина и формирования индуративного характера воспалительной тканевой реакции при ТБ важную роль играют альвеолярные макрофаги, обладающие способностью вырабатывать прокоагулянтные факторы, в частности тканевой тромбопластин и фактор V [8]. Развертывание патологических реакций в очаге воспаления активирует систему свертывания крови и влияет на локальное распределение фибрина, что вместе с коагулирующим воздействием на белковые субстанции альвеолярного экссудата иммунных комплексов и высвобождающихся липидных компонентов микобактериальной клетки приводит к образованию казеознофибринного сгустка. Последующий лизис фибрина в результате активации плазминовой системы в тканях и крови способствует расплавлению этого сгустка и образованию деструкции легочной ткани. Лизис обусловливается освобождением активатора плазминогена из эндотелия сосудистого, преимущественно венозного, русла, а также повышением активности альвеолярных макрофагов, также способных активировать фибринолиз и фагоцитировать фибрин и продукты его распада [8].
Как уже было сказано выше, важная роль в осуществлении метаболической функции легких, инициации и регуляции иммунного ответа на туберкулезную инфекцию принадлежит макрофагам, которые обладают сильным фагоцитарным и бактерицидным потенциалом, регулируют секреторную и пролиферативную активность других клеточных элементов, контролируют объем внеклеточного матрикса, инициируют и модулируют иммунные реакции. Соотношение числа активно фагоцитирующих и синтезирующих макрофагов не только отражает характер тканевой реакции, происходящей в зоне туберкулезного воспаления, но может служить показателем активности патологического процесса. Поэтому изучение состояния макрофагальной активности при деструктивном ТБ с множественной/широкой лекарственной устойчивостью представляется особо интересным, тем более что в научной литературе информация о распределении макрофагов в легочной ткани и их качественные характеристики имеет весьма разрозненный характер.
Согласно единичным исследованиям, CD68 позитивные клетки наиболее широко распространены в специфическом грануляционном слое стенки прогрессирующей фиброзной каверны, имеют различные размеры, интенсивность экспрессии и по своей природе являются гистиоцитами и эпителиоидными макрофагами. Этот факт объясняется активизацией макрофагальной системы именно в зоне бронхо-кавернозного свища, где в условиях повышенной аэрации наиболее активно внеклеточно и внутриклеточно размножаются МБТ. Часть эпителиоидных клеток, нагруженных микобактериями, объединяются и формируют многоядерные гигантские клетки, которые выполняют преимущественно секреторную функцию. При этом, выделяя медиаторы воспаления, такие макрофаги в кооперации с Т-лимфоцитами участвуют в эффекторной фазе специфического иммунного ответа, реакции гиперчувствительности замедленного типа и поддерживании хронического течения пролиферативного воспаления. Другая часть функционально-активных макрофагов в кооперации с нейтрофилами путем фагоцитоза и внеклеточного лизиса с помощью секреции ферментов (коллагеназы, эластазы, нейтральных протеиназ, кислых гидролаз), осуществляют функцию детоксикации – очищают ткань от продуктов распада клеток и межклеточного матрикса. Поступающие экзогенным путем микобактерии подвергаются процессингу в макрофагах, обязательным компонентом которых является эндосомальный компартмент, богатый молекулой CD68. Усиленное ферментное расщепление фагоцитируемого материала приводит также к лизису самой клетки, и, следовательно, к высвобождению антигенных детерминант, которые наблюдаются в очаге казеозного некроза. Если нарушается соотношение количества макрофагов в пользу таких клеток на фоне хронического иммунного воспаления, будут усиливаться прогрессирующие альтеративные процессы с активным бактериовыделением в зоне бронхо-кавернозного свища [16].
Приведенные в настоящем обзоре данные указывают, что в последние годы большую тревогу вызывает не просто ухудшение эпидемиологической ситуации по ТБ, а увеличение количества больных, выделяющих МБТ, устойчивые к противотуберкулезным препаратам. Распространение лекарственно-устойчивых штаммов является одной из наиболее актуальных проблем инфекционных болезней. Мировое сообщество обеспокоено угрозой развития эпидемии смертельно опасного ТБ с множественной лекарственной устойчивостью. Проблема лекарственной устойчивости актуальна по нескольким причинам. Заболевание, вызванное штаммом МБТ, устойчивым к противотуберкулезным препаратам, характеризуется быстрым развитием и генерализацией, протекает в виде тяжелых деструктивных форм, имеет распространенный характер с преобладанием альтеративно-экссудативного компонента, сочетается с выраженным иммунодефицитом и, соответственно, трудно поддается лечению. Особенности иммунологической характеристики клеточного состава ткани легких из очага специфического воспаления при ТБ легких с учетом лекарственной чувствительности микобактерий, чрезвычайно важны для оценки патологического процесса на конкретном этапе заболевания. Дальнейшее изучение детальной характеристики иммунокомпетентных клеток в очаге поражения будет способствовать более глубокому пониманию особенностей механизмов иммунопатогенеза и выбора тактики лечения.
