Эритропоэтин является не только основным регулятором эритропоэза [1, 13], но и индуктором экспрессии редокс-ферментов, что указывает на его антиокислительную роль в регуляции окислительного стресса [12, 20, 21]. Также показана роль эритропоэтина в подавлении индуцированного патогенными факторами (инфекции, окислительный стресс) эриптоза [14, 16].
Согласно существующим представлениям, окислительный метаболизм – комплекс свободнорадикальных реакций, процессов липопероксидации и антиокислительных систем в клетках и тканях, разбалансировка которых приводит к накоплению окисленных радикалов и липопероксидов, с последующим изменением свойств мембран и их дисфункцией [8], в том числе мембран эритроцитов [5]. Показано, что продукты липопероксидации индуцируют окислительную модификацию белков мембраны и цитоплазмы эритроцита, снижая тем самым кислородный метаболизм, что вызывает развитие патологического состояния – гемической и тканевой гипоксии [7, 9] и формирование в период беременности внутриутробной гипоксии плода. Вместе с тем, в литературе отсутствуют исследования роли эритропоэтина в регуляции структурно-функциональных свойств эритроцитов крови пуповины новорожденных от серопозитивных по цитомегаловирусу (ЦМВ) женщин с обострением инфекции в третьем триместре беременности.
Цель работы – оценить влияние эритропоэтина на липидный состав и свойства мембраны эритроцитов в крови пуповины новорожденных от ЦМВ-серопозитивных женщин с обострением инфекции в третьем триместре беременности.
Материалы и методы исследования
В исследование включены 35 новорожденных детей, рожденных от ЦМВ-серопозитивных женщин с обострением инфекции в третьем триместре беременности (основная группа). Контрольную группу составили 30 новорожденных, рожденных от ЦМВ-серонегативных женщин.
Критериями включения в исследование явились обострение ЦМВ инфекции в третьем триместре беременности, стойкая клиническая ремиссия герпесвирусной инфекции в период беременности. Критерии исключения из исследования: первичная или латентная ЦМВ инфекция, обострение других воспалительных заболеваний экстрагенитальной патологии и наличие инфекций, передающихся половым путем.
Клинический диагноз – обострение хронической ЦМВ инфекции – у беременных женщин устанавливали по наличию в периферической крови антител IgG к ЦМВ, высокоавидных IgG (индекс авидности >65%), а также ДНК ЦМВ, выявляемой методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), в содержимом цервикального канала и соскобе с буккального эпителия.
Определение типоспецифических антител IgG классов М и G, индекса авидности антител класса G осуществляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Stat-Fax 2100 (США) с использованием стандартных тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Выявление ДНК ЦМВ методами ПЦР проводили на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
Материалом для исследования служили плазма крови пуповины и эритроциты. Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов судили по содержанию в мембране эритроцитов активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП) [2]. Содержание лизофосфатидилхолина в мембране эритроцитов изучали методом тонкослойной хроматографии [6]. Жирные кислоты (олеиновая, α-линоленовая, арахидоновая) в мембране эритроцитов определяли методом газожидкостной хроматографии. Обработку данных пиков осуществляли по средствам программно-аппаратной установки Хроматэк Аналитик 2.5 по временам удержания с применением стандартных наборов (Supelco, США). Содержание сывороточного эритропоэтина оценивали иммуноферментным методом анализа с помощью наборов реактивов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург).
Измерение микровязкости (величина обратная текучести) мембраны эритроцитов проводили методом латеральной диффузии гидрофобного флуоресцентного зонда пирена [3]. Определение микровязкости основано на образовании эксимеров (активных димеров) пирена в липидном окружении. Флуоресценцию пирена измеряли на спектрофлюориметре Hitachi (Япония). Для определения микровязкости липидного бислоя находили интенсивность флуоресценции или свечение пирена при длине волны возбуждения 334 нм, длина волны мономеров 395 нм, длина волны эксимеров 470 нм. Оценка микровязкости основывается на вычислении коэффициента эксимеризации пирена (Кэкс.=F470/F395), который равен отношению интенсивности флуоресценции эксимеров к интенсивности флуоресценции мономеров. Коэффициент эксимеризации находится в обратной зависимости от микровязкости.
Содержание ионизированного кальция (Ca2+) в эритроцитах крови пуповины определяли на анализаторе газов крови и электролитов Medica EasyStat (США).
Количество эритроцитов определяли на гематологическом автоматическом анализаторе Medonic (Швеция). Морфологию эритроцитов и подсчет эхиноцитов осуществляли на микроскопе Motic (Япония) c последующей цитофотометрической обработкой данных на установке Mekos (Москва).
Исследования проведены в соответствии с кодексом этических принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации с поправками 2013 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Минздрава РФ №200н от 1 апреля 2016 года. На проведение исследования от каждой женщины было получено информационное согласие.
Статистический анализ и обработка данных проводился с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Определение достоверности различий средних значений сравниваемых параметров между разными выборками (M±m) проводилось с использованием непарного t-критерия Стьюдента (р).
Результаты исследования
Согласно приведенным в таблице данным, уровень эритропоэтина в крови пуповины новорожденных основной группы увеличивался на 20% (p<0,05) по сравнению с контрольной группой, что должно было сопровождаться усилением эритропоэза. Однако этого выявлено не было: эриптоз преобладал над эритропоэзом, что выражалось в уменьшении количества эритроцитов в крови пуповины основной группы новорожденных на 21% (p<0,01).
При оценке состава и свойств липидных компонентов мембраны эритроцитов в крови пуповины основной группы обращало внимание увеличение содержания лизофосфатидилхолина на 42% (p<0,001) и ТБК-АП на 60% (p<0,001) по сравнению с контрольной группой, что свидетельствовало об инициации процессов липопероксидации в ответ на формируемый гипоксический стимул.
Увеличение содержания лизофосфатидилхолина в эритроцитах крови пуповины является результатом действия фосфолипазы А2, которая высвобождает арахидоновую кислоту после оксидативного действия [4]. Было установлено увеличение ее содержания в эритроцитах крови пуповины новорожденных основной группы на 31% по сравнению с контрольной группой. При анализе содержания олеиновой и α-линоленовой кислот в эритроцитах крови пуповины основной группы новорожденных выявлено уменьшение их уровня (p<0,001) по сравнению с контрольной группой.
Оценивая свойства мембраны эритроцитов крови пуповины в основной группе новорожденных выявлено уменьшение отношения флюоресценции эксимеров и мономеров (Fэ/Fм) на 30% (p<0,001) по сравнению с контрольной группой, свидетельствующее об окислительной модификации липидных компонентов, пролонгирующей гиперосмотический шок и разрушение эритроцитов вследствие эхиноцитоза. В крови пуповины эритроцитов в основной группе новорожденных количество эхиноцитов увеличивалось на 91% (p<0,001), содержание ионизированного Ca2+ – на 14 % (p<0,05) по сравнению с контрольной группой.
Обсуждение результатов исследования
По нашим данным обострение ЦМВ инфекции в период беременности сопровождается экспрессией циркулируюших иммунных комплексов на мембране эритроцитов [19], инициирующих окислительные реакции и эриптоз. Последнее сопряжено с гемической (кровь матери) и тканевой (плацента) гипоксией, что изменяет кислородный метаболизм в крови плода вследствие эриптоза, способствуя развитию внутриутробной гипоксии.
В механизме развития внутриутробной гипоксии плода при обострении ЦМВ инфекции в третьем триместре беременности лежит снижение эффективности действия эритропоэтина, хотя его уровень в крови пуповины новорожденных повышен. Это приводит к инициации Са2+-зависимых ионных каналов (Са2+-АТФаза) и увеличению уровня цитоплазматического Са2+ в эритроцитах крови пуповины. Увеличение внутриклеточной концентрации свободного ионизированного Са2+ инициирует скремблирование фосфолипидов мембраны эритроцитов с перераспределением фосфатидилсерина из внутреннего на внешний липидный монослой [10, 22] с последующим экзоцитарным лизисом. Триггерами данного процесса являются окислительный стресс, гиперосмотический шок и дефицит АТФ [17, 18]. Доказательством нарушений окислительного метаболизма в крови пуповины новорожденных явилось увеличение содержания лизофосфатидилхолина, ТБК-АП, арахидоновой кислоты и уменьшение концентрации олеиновой и α-линоленовой кислоты, что увеличивало вязкостные и деформирующие свойства мембраны.
С другой стороны, повышение внутриклеточного содержания цитоплазматического Са2+ в эритроцитах крови пуповины может быть связано с активацией цистеиновой эндопептидазы – калпаина, субстратами которого являются белки цитоскелета – спектрин, актин [15] и белок полосы 3, а также мембраносвязанный транспортер – Са2+-АТФаза. В норме в эритроцитах калпаин находится в неактивной форме. Увеличение концентрации ионизированного Са2+ вызывает перемещение калпаина из цитоплазматического пространства в мембрану, где он подвергается аутопротеолитической активации. Активированный в эритроцитах калпаин инициирует каспазу 3 [11], субстратами которой также являются спектрин и актин. Развитие описанных выше событий приводит к активной везикуляции эритроцитов.
Повышение внутриклеточной концентрации ионизированного Ca+ также может активировать Са2+-зависимые калиевые каналы с последующим выходом K+ из эритроцита, что приводит к гиперполяризации клеточной мембраны и потере ионов хлора из клетки по электрохимическому градиенту. За выходом из эритроцита ионов калия и хлора следует потеря осмотически связанной воды [15], что морфологически проявляется в эхиноцитозе.
Таким образом, в крови пуповины новорожденных, рожденных от ЦМВ-серопозитивных женщин с обострением инфекции в третьем триместре беременности, нами установлено снижение эффективности действия эритропоэтина, усиливающего окислительное повреждение эритроцитов и накопление цитоплазматического Ca+, что приводит к гиперосмотическому шоку, эхиноцитозу и эриптозу.
