Russian Federation
Russian Federation
UDK 577.21 Молекулярные механизмы кодирования, запасания и реализации наследственной информации. Молекулярная биология гена (молекулярная генетика). Молекулярные механизмы матричного синтеза (биополимеризация)
Recently, the problem of convergent evolution of pathogens (viruses, bacteria) and macroorganism has been of great interest. In turn, the study of evolutionary variability, from the point of view of the virocentric model of evolution, can become an additional link in determining the direction of the evolution of life as a whole. Further study of the genetic variability of the ASF virus genes and the determination of the correlation between the properties of the virus, territorial affiliation and duration of persistence will provide a molecular epizootological picture of the spread of the disease in the Russian Federation. The EP402R marker gene encoding the CD2v protein is known to determine the hemadsorbing properties of the ASF virus, is involved in cell adhesion, and is also associated with virulence and modulation of the immune response. In order to detect changes in the marker gene EP402R of the ASF virus, we made a sample of twenty-two isolates isolated in the Russian Federation from 2017 to 2018. DNA of the ASF virus was isolated from all selected isolates and PCR of the EP402R gene of the ASF virus was performed, followed by extraction of the resulting nucleic acids from agarose gel. Sequence alignment was performed using the Bioedit program and the ClustalW algorithm. Sequencing of nucleotide sequences was carried out using specific primers for the EP402R gene fragment of the ASF virus. In the course of our work, it was found that isolates isolated from domestic pigs and wild boars did not contain genetic changes in the EP402R gene. This region of the genome was found to be identical to the original genome-wide reference strain "Georgia 2007/1".
african swine fever, EP402R gene, isolates, strains, domestic pigs, wild boars, marker gene
Африканская чума свиней (AЧС) – это геморрагическая болезнь домашних свиней и диких кабанов (Suidae). Вирус АЧС представляет собой крупный икосаэдрический, двухцепочечный ДНК вирус, содержащий 170-190 тыс. п.н. в зависимости от штамма [1, 2].
Высокая смертность среди домашних свиней приводит к серьезным экономическим потерям в свиноводстве [3].
Домашние свиньи и европейские дикие кабаны высоко восприимчивы к заболеванию и при первичном ее попадании в их популяцию отмечают, как правило, острую и подострую формы болезни, с высокой летальностью, достигающей 100% [4]. Контроль вируса АЧС органичен применением диагностических тестов и противоэпизоотическими мероприятиями в связи с отсутствием безопасных и эффективных средств защиты животных от этой болезни [5, 6].
На сегодняшний день известно, что вирус АЧС имеет 24 генотипа [7]. На данный момент на территории Российской Федерации циркулирует вирус АЧС, относящийся ко II генотипу и 8 сероиммунотипу [4].
Изучение различных штаммов и изолятов относящихся к различным генотипам вируса АЧС с применением филогенетического анализа и молекулярно-генетического анализа близких по структуре генов в дальнейшем позволит изучить связи между вирусами и их распространением в пространстве и времени [8]. Изучение молекулярно-генетических характеристик позволит лучше изучить и контролировать процессы генетической изменчивости и разнообразия вируса АЧС и подобрать изоляты и штаммы, которые могли быть использованы при разработке вакцин [9].
Цель исследования – провести анализ нуклеотидных последовательностей отечественных изолятов вируса африканской чумы свиней по гену EP402R.
Условия, материалы и методы. Исследование осуществлялось на базе ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии». Объектами исследования являлись 20 отечественных изолятов вируса АЧС выделенных на территории Российской Федерации в 2017 г. Материалом для выделения ДНК вируса АЧС были использованы селезенка, лимфоузлы и костный мозг. Подтверждали наличие генома вируса АЧС в образцах с помощью ПЦР в режиме реального времени.
Для выделения ДНК из патматериала использовали набор «ДНК-сорб» (Интерлабсервис, Россия), согласно инструкции производителя. Геном вируса АЧС выявляли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ) на амплификаторе CFX96 (BioRad, США) с помощью праймеров и зонда [10]. Оптимальный температурный режим и количество циклов для прибора «СFX 96» составлял: 3 мин денатурации при температуре 94°C; отжиг праймеров при 53°C – 30 сек, элонгация при 72°C – 45 сек. (40 циклов).
Анализ продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, содержащим интеркалирующий краситель бромистый этидий с последующим учетом на ChemiDoc MP («Bio-RadLaboratories», США). Электрофорез проводили при силе тока 50 мА и напряжении 150 В течение 40 минут. ДНК визуализировали на документирующей системе «ChemiDoc MP» («Bio-RadLaboratories», США) в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.
Выделение нуклеиновых кислот из геля, в дальнейшем используемых для постановки ПЦР, секвенирования и рестрикции, проводили согласно методике производителя набора «Cleanup – standard» («Евроген», Россия). Сиквенсоваяреакция фрагментов была осуществлена при помощи компонентов «BigDye X Terminator v.3.1.» («AppliedBiosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Постановку реакции проводили с использованием специфических для определенного фрагмента генома праймеров:
EP402R (ga4124F) – (5'CTGAATCTAATGAAGAAGA3');
EP402R (ga4698R) – (5'AAGTCTTTGTAGGTTTTTCGTT) [11].
Анализ нуклеотидных последовательностей гена B602L вируса АЧС проводили в автоматическом секвенаторе «GeneticAnalyzer 3130» («AppliedBiosystems», США) согласно рекомендациям изготовителя.
Сборку и выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей фрагментов гена EP402R изолятов вируса АЧС осуществляли с использованием компьютерной программы «BioEdit v.7» [12].
Далее осуществляли сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями гена EP402R вируса АЧС взятых из базы данных «GenBank» с использованием программы «BLASTN» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [13].
Результаты и обсуждения. Маркерный ген EP402R участвует в кодировании вирусного трансмембранного белка CD2v, обладающий структурным и функциональным сходством с мембранным антигеном лимфоцитов CD2, который принимает участие в адгезии клеток и модуляции иммунного ответа [14]. Ген EP402R транскрибируется в инфицированных вирусом клетках свиных макрофагов и культуре клеток Vero в поздние сроки инфекционного цикла. Известно, что CD2v отвечает за способность к гемадсорбции вируса АЧС, а возникающие делеции в этом гене снижает число эритроцитов, вокруг инфекционной клетки [15].
Принимая участие в клеточной адгезии CD2v способствует повышению вирулентности и модуляции иммунного ответа. В экспериментах на животных была продемонстрирована его ведущая роль в патогенезе инфекции, тканевом тропизме, иммунном «уклонении» и усилении репликации вируса [16].
Удаление маркерного гена EP402R может привести к различным фенотипическим результатам invivo в зависимости от штамма вируса АЧС. Однако возникающая делеция в гене EP402R приводит к полному ослаблению многих вирулентных штаммов у домашних свиней. Обнаруженная делеция этого гена у штамма MalawiLil-20/1 и CN/GS/2018 не привела к ослаблению вирулентности у свиней [17, 18, 19].
В своей работе А. Мазлум с соавт. использовали ген EP402R для изучения распространения вируса АЧCII генотипа среди изолятов циркулировавших в Российской Федерации [20]. Авторами было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей пяти отечественных изолятов выделенных на территории РФ в 2014-2016 гг. и пяти польских изолятов взятых из международной базы GenBank. Штамм «Georgia 2007/1» использовали для сравнительного анализа т.к. он являлся родоначальным штаммом, давшим начало распространению вируса АЧС в странах Кавказа и Европы [20].
В результате проведенных исследований, были выявлены изменения в нуклеотидных последовательностях участка гена EP402R у польских и отечественных изолятов вируса АЧС. У изолята «Krasnodar 07/15» были обнаружены замены нуклеотидов с T/A.
А у изолятов выделенных на территории Польши в ходе анализа были выявлены единичные замены T/C в позиции 596 и дополнительный нуклеотид C в позиции 605 участка гена EP402R вируса АЧС. Польский изолят Case 42 не содержал замену T/C.
С целью обнаружения изменений в маркерном гене EP402R вируса АЧС нами была произведена выборка из двадцати двух изолятов выделенных в 2017-2018 годах в трех Федеральных округах (Центральном, Приволжском, и Южном) РФ. Среди двадцати двух выбранных отечественных изолятов 10 образцов было выделено от домашних свиней и 12 от диких кабанов (табл. 1).
Таблица 1– Изоляты вируса АЧС использованные в работе
|
п/п |
Дата |
Изолят |
Место |
Вид животного |
|
1. |
06.01.2017 |
Республика Крым |
Советский р-н, с. Дмитровка, ГБУ "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория" |
домашняя свинья |
|
2 |
02.02.2017 |
Саратовская область |
Энгельсовский р-н, Кр. Партизан |
домашняя свинья |
|
3. |
18.02.2017 |
Саратовская область |
Романовский р-н, М. Карай |
домашняя свинья |
|
4. |
20.02.2017 |
Орловская область |
Мценский район, д. Хапово |
дикий кабан |
|
5 |
16.03.2017 |
Самарская область |
Хворостянский р-н, с. Гремячка |
домашняя свинья |
|
6. |
04.04.2017 |
Московская область |
Раменский р-н, с. Константиновское |
домашняя свинья |
|
7. |
05.04.2017 |
Московская область |
Ленинский р-н, с.п. Молоковское |
домашняя свинья |
|
8. |
05.06.2017 |
Волгоградская область |
Среднеахтубинский, р-н, х. Бакалда |
домашняя свинья |
|
9. |
01.08.2017 |
Белгородская область |
г. Белгород, ООО «Муромский лес» |
дикий кабан |
|
10. |
26.10.2017 |
Белгородcкая область |
Прохоровский р-н, с. Ржавец |
дикий кабан |
|
11 |
27.10.2017 |
Белгородская область |
Корочанский р-н, с. Соколовка |
дикий кабан |
|
12. |
13.11.2017 |
Белгородская область |
Шебекинский р-н, с. Шамино |
дикий кабан |
|
13. |
17.11.2017 |
Белгородская область |
Валуйский р-н,п. Нижние Мельницы |
дикий кабан |
|
14. |
23.11.2017 |
Белгородская область |
Корочанский р-н, с. Мазино |
домашняя свинья |
|
15. |
28.11.2017 |
Белгородская область |
Корочанский р-н, с. Мазикино 28/04/18 |
дикий кабан |
|
16. |
08.12.2017 |
Белгородская область |
Шебекинский р-н, с. Зимовное х. Новая заря |
дикий кабан |
|
17. |
08.12.2017 |
Белгородская область |
Корочанский р-н, с. Ивица |
дикий кабан |
|
18. |
04.04.2018 |
Белгородская область |
Новооскольский р-н |
дикий кабан |
|
19. |
10.04.2018 |
Саратовская область |
Хвалынский р-н, с. Елшанка. |
домашняя свинья |
|
20. |
12.04.2018 |
Республика Крым |
Белогорский район, с. Межгорье |
дикий кабан |
|
21. |
28.04.2018 |
Белгородская область |
Щебекинский р-н, с. Батрацкая Дача |
дикий кабан |
|
22. |
18.07.2018 |
Белгородская область |
Щебекинский р-н, с. Булановка. |
домашняя свинья |
Далее следующим этапом нашей работы являлось выделение ДНК вируса АЧС из всех отечественных изолятов и проведение ПЦР фрагментов генома вируса АЧС, содержащих ген EP402R. Полученные нуклеотидные последовательности секвенировали с использованием специфических праймеров к маркерному гену EP402R и анализировали с применением программы «Bioedit» и алгоритма «ClustalW». Для сравнения нуклеотидных последовательностей гена EP402R восемнадцати отечественных изолятов был использован полногеномный референс-штамм «Georgia 2007/1» (FR682468.2), который впервые был обнаружен в 2007 году. Этот референтный штамм относится ко II генотипу и 8 серотипу.
Анализ нуклеотидных последовательностей представленных изолятов по фрагменту гена EP402R не выявил изменений по сравнению с рефернтным штаммом «Georgia2007/1» (FR682468.2) (рисунок 1).
Таким образом, в результате проведенного нами исследования всего было проанализировано двадцать два отечественных изолятов вируса АЧС. Полученные нами данные в ходе анализа по маркерному гену EP402R позволяют утверждать о том, что изоляты циркулировавшие на территории России с 2017 по 2018 гг. не обладали генетической вариабельностью данного гена.
Рисунок 1 – Выравненные фрагменты нуклеотидных последовательностей гена EP402R изолятов с 2017 по 2018 гг. вируса АЧС
Выводы. Таким образом, исследования в данном направлении являются реальным шагом на пути к формированию системы геномных маркеров, которые можно использовать для обнаружения и отслеживания эволюции возбудителя АЧС. Отечественные изоляты вируса АЧС циркулировавшие с 2017 по 2018 гг. в трех Федеральных округах (Центральном, Приволжском, и Южном) являются генетически стабильными по фрагменту маркерного гена EP402R.
Резюмируя вышесказанное, основными направлениями в области изучения биологии вирусов являются изучение функций отдельных генов, их роли во взаимодействии с клеткой-хозяином и влияние на эволюционную изменчивость, как самого вируса, так и восприимчивого организма.
1. Current status of African swine fever virus in a population of wild boar in Eastern Poland (2014-2015) / G. Wozniakowski, E. Kozak, A. Kowalczyk et al. // Arch. Virol. 2016. Vol. 161. P.189-195. DOI:https://doi.org/10.1007/s00705-015-2650-5.
2. African swine fever in the territory of the Russian Federation: economic consequences / V.M. Gulenkin, I.M. Klinovitskaya, O.N. Petrova and others // Veterinary science today. 2017. No. 4. pp. 23 - 27.
3. Gruzdev K. N., Zakutsky N. I., Diev V. I. African swine fever: current state, epizootology and control measures (analytical review) // Veterinary doctor. 2017. No. 5. pp. 3-10.
4. ICTV Virus Taxonomy Profile: Asfarviridae / C. Alonso, M. Borca, L. Dixon et al. // J. Gen. Virol. 2018 Vol. 99, No. 5.P. 613-614.
5. Makarov V.V. African swine fever / Makarov V.V. - M.: RUDN, 2011. 268 p.
6. Izotova O. G., Goryacheva M. M. African swine fever as a threat to domestic pig breeding // Modern problems of innovative development of science. Collection of articles of the International scientific-practical conference. - Ufa: OMEGA-SINES, 2017. P.274-276.
7. Mazur-Panasiuk, N. The first complete genomic sequences of African swine fever virus isolated in Poland / N. Mazur-Panasiuk, G. Woźniakowski, K. Niemczuk // Scientific Reports. 2019 Vol. 9. No. 1. P. 4556.
8. Genetic characterization of African swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domestic interface in Mozambique and identification of a novel genotype / Quembo C.J., Jori F., Vosloo W. et al.// Transbound. Emerge.Dis. 2018 Vol. 65, No. 2. P. 420-431.
9. Phylogeographic analysis of African swine fever virus, Western Europe, 2018 / M. Garigliany, Desmecht D., Tignon M. et al. // Emerge. Infect. Dis. 2019 Vol. 25, pp. 184-186.
10. Kudryashov D.A., Burmakina G.S., Titov I.A. Oligonucleotide primers and an internal quencher fluorescent probe complementary to the P30 (CP204L) gene region of African swine fever virus for use in real-time polymerase chain reaction. MPK7C12Q 1/68 // RF Patent No. 2606253, 01/10/2017
11. African swine fever virus CD2v and C- type lectin gene loci mediate serological specificity / A. Malogolovkin, G. Burmakina, E.R. Tulman et al. // The J. Gen Virol. 2015. Vol. 96, P. 866-873.
12. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symp. Ser. 1999 Vol. 41. R. 95 - 98. DOI:https://doi.org/10.14601/Phytopathol_Mediterr-14998u1.29.
13. A greedy algorithm for aligning DNA sequences / Z. Zhang, S. Schwartz, L. Wagner et al. // Journal of Computational Biology. 2000 Vol. 7, P. 203-214.
14. An African swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption / M.V. Borca, G.K. Kutish, C.L. Afonso et al. // Virology. 1994b. Vol. 199. P. 463-468.
15. Standardization of pathological investigations in the framework of experimental ASFV infections / I. Galindo-Cardiel, M. Ballester, D. Solanes et al. // J. Virus Res. 2013. P. 11.
16. The CD2v protein enhances African swine fever virus replication in the tick vector, Ornithodoroserraticus / R.J. Rowlands et al. // Virology. 2009 Vol. 393, No. 2. P. 319-328.
17. BA71ΔCD2: A New Recombinant Live Attenuated African Swine Fever Virus with Cross-Protective Capabilities // P.L. Monteagudo, A. Lacasta, E. Lopez et al. // J. Virol. 2017 Vol. 91. DOI:https://doi.org/10.1128/JVI.01058-17.
18. A Seven-Gene-Deleted African Swine Fever Virus Is Safe and Effective as a Live Attenuated Vaccine in Pigs / W. Chen, D. Zhao, X. He et al. //Sci. China Life Sci. 2020 Vol. 3. P. 623-634. DOI:https://doi.org/10.1007/s11427-020-1657-9.
19. Deletion of a CD2-Like Gene, 8-DR, from African Swine Fever Virus Affects Viral Infection in Domestic Swine / M.V. Borca, C. Carrillo, L. Zsak // Virol. 1998. Vol.72. P. 2881-2889. DOI:https://doi.org/10.1128/JVI.72.4.2881-2889.1998.
20. African swine fever virus: the use of genetic markers in the analysis of its spread / A. Mazlum, A.S. Igolkin, N.N. Vlasova and others // Veterinary science today. 2019. №3. pp. 3-14.
