Россия
Россия
УДК 577.21 Молекулярные механизмы кодирования, запасания и реализации наследственной информации. Молекулярная биология гена (молекулярная генетика). Молекулярные механизмы матричного синтеза (биополимеризация)
В последнее время большой интерес представляет проблема конвергентной эволюции возбудителей (вирусы, бактерии) и макроорганизма. В свою очередь, изучение эволюционной изменчивости, с точки зрения вироцентрической модели эволюции, может стать дополнительным звеном в определении направления эволюции жизни в целом. Дальнейшее изучение генетической вариабельности генов вируса АЧС и определение корреляции между свойствами вируса, территориальной принадлежностью и сроками персистенции позволят получить молекулярно - эпизоотологическую картину распространения заболевания на территории Российской Федерации. Маркерный ген EP402R, кодирующий белок CD2v, как известно, обуславливает гемадсорбирующие свойства вируса АЧС, участвует в клеточной адгезии, а также связан с вирулентностью и модуляцией иммунного ответа. С целью обнаружения изменений в маркерном гене EP402R вируса АЧС нами была произведена выборка из двадцати двух изолятов выделенных в Российской Федерации с 2017 по 2018 гг. ДНК вируса АЧС была выделена из всех выбранных изолятов и проведена ПЦР гена EP402R вируса АЧС с последующей экстракцией полученных нуклеиновых кислот из агарозного геля. Выравнивание последовательностей выполнялось с использованием программы «Bioedit» и алгоритма «ClustalW». Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводилось с применением специфических праймеров для фрагмента гена EP402R вируса АЧС. В ходе нашей работы было установлено, что изоляты выделенные от домашних свиней и диких кабанов не содержали генетических изменений по гену EP402R. Эта область генома оказалась идентичной исходному полногеномному референс-штамму «Georgia 2007/1».
африканская чума свиней, ген EP402R, изоляты, штаммы, домашние свиньи, дикие кабаны, маркерный ген
Африканская чума свиней (AЧС) – это геморрагическая болезнь домашних свиней и диких кабанов (Suidae). Вирус АЧС представляет собой крупный икосаэдрический, двухцепочечный ДНК вирус, содержащий 170-190 тыс. п.н. в зависимости от штамма [1, 2].
Высокая смертность среди домашних свиней приводит к серьезным экономическим потерям в свиноводстве [3].
Домашние свиньи и европейские дикие кабаны высоко восприимчивы к заболеванию и при первичном ее попадании в их популяцию отмечают, как правило, острую и подострую формы болезни, с высокой летальностью, достигающей 100% [4]. Контроль вируса АЧС органичен применением диагностических тестов и противоэпизоотическими мероприятиями в связи с отсутствием безопасных и эффективных средств защиты животных от этой болезни [5, 6].
На сегодняшний день известно, что вирус АЧС имеет 24 генотипа [7]. На данный момент на территории Российской Федерации циркулирует вирус АЧС, относящийся ко II генотипу и 8 сероиммунотипу [4].
Изучение различных штаммов и изолятов относящихся к различным генотипам вируса АЧС с применением филогенетического анализа и молекулярно-генетического анализа близких по структуре генов в дальнейшем позволит изучить связи между вирусами и их распространением в пространстве и времени [8]. Изучение молекулярно-генетических характеристик позволит лучше изучить и контролировать процессы генетической изменчивости и разнообразия вируса АЧС и подобрать изоляты и штаммы, которые могли быть использованы при разработке вакцин [9].
Цель исследования – провести анализ нуклеотидных последовательностей отечественных изолятов вируса африканской чумы свиней по гену EP402R.
Условия, материалы и методы. Исследование осуществлялось на базе ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии». Объектами исследования являлись 20 отечественных изолятов вируса АЧС выделенных на территории Российской Федерации в 2017 г. Материалом для выделения ДНК вируса АЧС были использованы селезенка, лимфоузлы и костный мозг. Подтверждали наличие генома вируса АЧС в образцах с помощью ПЦР в режиме реального времени.
Для выделения ДНК из патматериала использовали набор «ДНК-сорб» (Интерлабсервис, Россия), согласно инструкции производителя. Геном вируса АЧС выявляли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ) на амплификаторе CFX96 (BioRad, США) с помощью праймеров и зонда [10]. Оптимальный температурный режим и количество циклов для прибора «СFX 96» составлял: 3 мин денатурации при температуре 94°C; отжиг праймеров при 53°C – 30 сек, элонгация при 72°C – 45 сек. (40 циклов).
Анализ продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, содержащим интеркалирующий краситель бромистый этидий с последующим учетом на ChemiDoc MP («Bio-RadLaboratories», США). Электрофорез проводили при силе тока 50 мА и напряжении 150 В течение 40 минут. ДНК визуализировали на документирующей системе «ChemiDoc MP» («Bio-RadLaboratories», США) в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.
Выделение нуклеиновых кислот из геля, в дальнейшем используемых для постановки ПЦР, секвенирования и рестрикции, проводили согласно методике производителя набора «Cleanup – standard» («Евроген», Россия). Сиквенсоваяреакция фрагментов была осуществлена при помощи компонентов «BigDye X Terminator v.3.1.» («AppliedBiosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Постановку реакции проводили с использованием специфических для определенного фрагмента генома праймеров:
EP402R (ga4124F) – (5'CTGAATCTAATGAAGAAGA3');
EP402R (ga4698R) – (5'AAGTCTTTGTAGGTTTTTCGTT) [11].
Анализ нуклеотидных последовательностей гена B602L вируса АЧС проводили в автоматическом секвенаторе «GeneticAnalyzer 3130» («AppliedBiosystems», США) согласно рекомендациям изготовителя.
Сборку и выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей фрагментов гена EP402R изолятов вируса АЧС осуществляли с использованием компьютерной программы «BioEdit v.7» [12].
Далее осуществляли сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями гена EP402R вируса АЧС взятых из базы данных «GenBank» с использованием программы «BLASTN» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [13].
Результаты и обсуждения. Маркерный ген EP402R участвует в кодировании вирусного трансмембранного белка CD2v, обладающий структурным и функциональным сходством с мембранным антигеном лимфоцитов CD2, который принимает участие в адгезии клеток и модуляции иммунного ответа [14]. Ген EP402R транскрибируется в инфицированных вирусом клетках свиных макрофагов и культуре клеток Vero в поздние сроки инфекционного цикла. Известно, что CD2v отвечает за способность к гемадсорбции вируса АЧС, а возникающие делеции в этом гене снижает число эритроцитов, вокруг инфекционной клетки [15].
Принимая участие в клеточной адгезии CD2v способствует повышению вирулентности и модуляции иммунного ответа. В экспериментах на животных была продемонстрирована его ведущая роль в патогенезе инфекции, тканевом тропизме, иммунном «уклонении» и усилении репликации вируса [16].
Удаление маркерного гена EP402R может привести к различным фенотипическим результатам invivo в зависимости от штамма вируса АЧС. Однако возникающая делеция в гене EP402R приводит к полному ослаблению многих вирулентных штаммов у домашних свиней. Обнаруженная делеция этого гена у штамма MalawiLil-20/1 и CN/GS/2018 не привела к ослаблению вирулентности у свиней [17, 18, 19].
В своей работе А. Мазлум с соавт. использовали ген EP402R для изучения распространения вируса АЧCII генотипа среди изолятов циркулировавших в Российской Федерации [20]. Авторами было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей пяти отечественных изолятов выделенных на территории РФ в 2014-2016 гг. и пяти польских изолятов взятых из международной базы GenBank. Штамм «Georgia 2007/1» использовали для сравнительного анализа т.к. он являлся родоначальным штаммом, давшим начало распространению вируса АЧС в странах Кавказа и Европы [20].
В результате проведенных исследований, были выявлены изменения в нуклеотидных последовательностях участка гена EP402R у польских и отечественных изолятов вируса АЧС. У изолята «Krasnodar 07/15» были обнаружены замены нуклеотидов с T/A.
А у изолятов выделенных на территории Польши в ходе анализа были выявлены единичные замены T/C в позиции 596 и дополнительный нуклеотид C в позиции 605 участка гена EP402R вируса АЧС. Польский изолят Case 42 не содержал замену T/C.
С целью обнаружения изменений в маркерном гене EP402R вируса АЧС нами была произведена выборка из двадцати двух изолятов выделенных в 2017-2018 годах в трех Федеральных округах (Центральном, Приволжском, и Южном) РФ. Среди двадцати двух выбранных отечественных изолятов 10 образцов было выделено от домашних свиней и 12 от диких кабанов (табл. 1).
Таблица 1– Изоляты вируса АЧС использованные в работе
|
п/п |
Дата |
Изолят |
Место |
Вид животного |
|
1. |
06.01.2017 |
Республика Крым |
Советский р-н, с. Дмитровка, ГБУ "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория" |
домашняя свинья |
|
2 |
02.02.2017 |
Саратовская область |
Энгельсовский р-н, Кр. Партизан |
домашняя свинья |
|
3. |
18.02.2017 |
Саратовская область |
Романовский р-н, М. Карай |
домашняя свинья |
|
4. |
20.02.2017 |
Орловская область |
Мценский район, д. Хапово |
дикий кабан |
|
5 |
16.03.2017 |
Самарская область |
Хворостянский р-н, с. Гремячка |
домашняя свинья |
|
6. |
04.04.2017 |
Московская область |
Раменский р-н, с. Константиновское |
домашняя свинья |
|
7. |
05.04.2017 |
Московская область |
Ленинский р-н, с.п. Молоковское |
домашняя свинья |
|
8. |
05.06.2017 |
Волгоградская область |
Среднеахтубинский, р-н, х. Бакалда |
домашняя свинья |
|
9. |
01.08.2017 |
Белгородская область |
г. Белгород, ООО «Муромский лес» |
дикий кабан |
|
10. |
26.10.2017 |
Белгородcкая область |
Прохоровский р-н, с. Ржавец |
дикий кабан |
|
11 |
27.10.2017 |
Белгородская область |
Корочанский р-н, с. Соколовка |
дикий кабан |
|
12. |
13.11.2017 |
Белгородская область |
Шебекинский р-н, с. Шамино |
дикий кабан |
|
13. |
17.11.2017 |
Белгородская область |
Валуйский р-н,п. Нижние Мельницы |
дикий кабан |
|
14. |
23.11.2017 |
Белгородская область |
Корочанский р-н, с. Мазино |
домашняя свинья |
|
15. |
28.11.2017 |
Белгородская область |
Корочанский р-н, с. Мазикино 28/04/18 |
дикий кабан |
|
16. |
08.12.2017 |
Белгородская область |
Шебекинский р-н, с. Зимовное х. Новая заря |
дикий кабан |
|
17. |
08.12.2017 |
Белгородская область |
Корочанский р-н, с. Ивица |
дикий кабан |
|
18. |
04.04.2018 |
Белгородская область |
Новооскольский р-н |
дикий кабан |
|
19. |
10.04.2018 |
Саратовская область |
Хвалынский р-н, с. Елшанка. |
домашняя свинья |
|
20. |
12.04.2018 |
Республика Крым |
Белогорский район, с. Межгорье |
дикий кабан |
|
21. |
28.04.2018 |
Белгородская область |
Щебекинский р-н, с. Батрацкая Дача |
дикий кабан |
|
22. |
18.07.2018 |
Белгородская область |
Щебекинский р-н, с. Булановка. |
домашняя свинья |
Далее следующим этапом нашей работы являлось выделение ДНК вируса АЧС из всех отечественных изолятов и проведение ПЦР фрагментов генома вируса АЧС, содержащих ген EP402R. Полученные нуклеотидные последовательности секвенировали с использованием специфических праймеров к маркерному гену EP402R и анализировали с применением программы «Bioedit» и алгоритма «ClustalW». Для сравнения нуклеотидных последовательностей гена EP402R восемнадцати отечественных изолятов был использован полногеномный референс-штамм «Georgia 2007/1» (FR682468.2), который впервые был обнаружен в 2007 году. Этот референтный штамм относится ко II генотипу и 8 серотипу.
Анализ нуклеотидных последовательностей представленных изолятов по фрагменту гена EP402R не выявил изменений по сравнению с рефернтным штаммом «Georgia2007/1» (FR682468.2) (рисунок 1).
Таким образом, в результате проведенного нами исследования всего было проанализировано двадцать два отечественных изолятов вируса АЧС. Полученные нами данные в ходе анализа по маркерному гену EP402R позволяют утверждать о том, что изоляты циркулировавшие на территории России с 2017 по 2018 гг. не обладали генетической вариабельностью данного гена.
Рисунок 1 – Выравненные фрагменты нуклеотидных последовательностей гена EP402R изолятов с 2017 по 2018 гг. вируса АЧС
Выводы. Таким образом, исследования в данном направлении являются реальным шагом на пути к формированию системы геномных маркеров, которые можно использовать для обнаружения и отслеживания эволюции возбудителя АЧС. Отечественные изоляты вируса АЧС циркулировавшие с 2017 по 2018 гг. в трех Федеральных округах (Центральном, Приволжском, и Южном) являются генетически стабильными по фрагменту маркерного гена EP402R.
Резюмируя вышесказанное, основными направлениями в области изучения биологии вирусов являются изучение функций отдельных генов, их роли во взаимодействии с клеткой-хозяином и влияние на эволюционную изменчивость, как самого вируса, так и восприимчивого организма.
1. Current status of African swine fever virus in a population of wild boar in Eastern Poland (2014-2015) / G. Wozniakowski, E. Kozak, A. Kowalczyk et al. // Arch. Virol. 2016. Vol. 161. P.189-195.DOI:https://doi.org/10.1007/s00705-015-2650-5.
2. Африканская чума свиней на территории Российской Федерации: экономические последствия / В.М. Гуленкин, И.М. Клиновицкая, О.Н. Петрова и др. // Ветеринария сегодня. 2017. №4. С. 23 - 27.
3. Груздев К. Н., Закутский Н. И., Диев В. И. Африканская чума свиней: современное состояние, эпизоотология и меры борьбы (аналитический обзор) // Ветеринарный врач. 2017. №5. С. 3-10.
4. ICTV Virus Taxonomy Profile: Asfarviridae / C. Alonso, M. Borca, L. Dixon et al. // J. Gen. Virol. 2018. Vol. 99, № 5.P. 613-614.
5. Макаров В.В. Африканская чума свиней / Макаров В. В . - М.: РУДН, 2011. 268 с.
6. Изотова О. Г., Горячева М. М. Африканская чума свиней как угроза отечественному свиноводству// Современные проблемы инновационного развития науки. Сборник статей Международной научно-практической конференции. - Уфа: ОМЕГА-САЙНС, 2017. С.274-276.
7. Mazur-Panasiuk, N. The first complete genomic sequences of African swine fever virus isolated in Poland / N. Mazur-Panasiuk, G. Woźniakowski, K. Niemczuk // Scientific Reports. 2019. Vol. 9. № 1. P. 4556.
8. Genetic characterization of African swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domestic interface in Mozambique and identification of a novel genotype / Quembo C.J., Jori F., Vosloo W. et al.// Transbound. Emerg.Dis. 2018.Vol. 65, № 2. P. 420-431.
9. Phylogeographic analysis of African swine fever virus, Western Europe, 2018 / M. Garigliany, Desmecht D., Tignon M. et al. // Emerg. Infect. Dis. 2019. Vol. 25, P. 184 -186.
10. Кудряшов Д.А., Бурмакина Г.С., Титов И.А. и др. Олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентный зонд с внутренним гасителем, комплементарные участку гена Р30 (CP204L) вируса африканской чумы свиней, для использования в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. МПК7C12Q 1/68 // Патент РФ № 2606253, 10.01.2017
11. African swine fever virus CD2v and C- type lectin gene loci mediate serological specificity / A. Malogolovkin, G. Burmakina, E.R. Tulman et al. // The J. GenVirol. 2015. Vol. 96, P. 866-873.
12. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symp. Ser. 1999. Vol. 41. Р. 95 - 98. DOIhttps://doi.org/10.14601/Phytopathol_Mediterr-14998u1.29.
13. A greedy algorithm for aligning DNA sequences / Z. Zhang, S. Schwartz, L. Wagner et al. // Journal of Computational Biology. 2000. Vol. 7, P. 203-214.
14. An African swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption / M.V. Borca, G.K. Kutish, C.L. Afonso et al. // Virology. 1994b. Vol. 199. P. 463-468.
15. Standardization of pathological investigations in the framework of experimental ASFV infections / I. Galindo-Cardiel, M. Ballester, D. Solanes et al. // J. Virus Res. 2013. P. 11.
16. The CD2v protein enhances African swine fever virus replication in the tick vector, Ornithodoroserraticus / R.J. Rowlands et al. // Virology. 2009. Vol. 393, № 2. P. 319-328.
17. BA71ΔCD2: A New Recombinant Live Attenuated African Swine Fever Virus with Cross-Protective Capabilities // P.L. Monteagudo, A. Lacasta, E. López et al. // J. Virol. 2017. Vol. 91. DOI:https://doi.org/10.1128/JVI.01058-17.
18. A Seven-Gene-Deleted African Swine Fever Virus Is Safe and Effective as a Live Attenuated Vaccine in Pigs / W. Chen, D. Zhao, X. He et al. // Sci. China Life Sci. 2020.Vol. 3. P. 623-634. DOI:https://doi.org/10.1007/s11427-020-1657-9.
19. Deletion of a CD2-Like Gene, 8-DR, from African Swine Fever Virus Affects Viral Infection in Domestic Swine / M.V. Borca, C. Carrillo, L. Zsak // Virol. 1998. Vol.72. P. 2881-2889. DOI:https://doi.org/10.1128/JVI.72.4.2881-2889.1998.
20. Вирус африканской чумы свиней: использование генетических маркеров при анализе путей его распространении / А. Мазлум, А.С. Иголкин, Н.Н. Власова и др. // Ветеринария сегодня. 2019. №3. С. 3-14.
