Kazan', Russian Federation
UDK 632.9 Борьба с болезнями и вредителями растений
The studies were conducted to determine the protective effect demonstrated by a consortium of bacteria, isolated from barley rhizosphere, against root rot. The work was carried out on a model system in the laboratory and on barley plants in the field. Under laboratory conditions, the consortium was tested for the absence of phytotoxicity towards spring barley plants and for the ability to inhibit the development of root rot on a tomato-Fusarium oxysporum model system, where 31% decrease in disease development was demonstrated, compared to the control. Field experiments were conducted in 2023-2024 in the Republic of Tatarstan. The soil is gray forest heavy loam. For field experiments of the consortium, Kamashevskiy barley seeds were treated with a fungal spore suspension at a concentration of 104 CFU/ml at a rate of 4 l/t on the day of sowing. Root rot was observed both in the control and in the experimental variant - the development of disease in 2023 reached 17.1% and 9%, respectively, in 2024 - 12.6% and 7%. Despite the effect on root rot, the differences between the values of biometric indicators were statistically insignificant. The productivity in 2023 in the control variant was 41.5 c/ha, in the experimental it was significantly higher by 7.9 c/ha (HSR005 - 6.3 c/ha). In 2024 there were no significant differences between experimental and control variants, the yield was 43.0...44.5 c/ha with a lower value of this indicator in the control. Thus, the consortium of bacteria from the rhizosphere of spring barley is able to restrain the development of root rot without having a toxic effect on plants.
barley, root rot, phytotoxicity, consortium of microorganisms, plant protection
Альтернативу химической обработки для культурных растений, основной запас фитопатогенной микрофлоры которых находится на семенах и в почве, давно пытаются реализовать с помощью бактериальных штаммов, активно колонизирующих растительные ткани или их поверхности и способных ограничивать развитие в этой нише фитопатогенов, в частности корневых гнилей и возбудителей пятнистостей ячменя [1, 2]. При этом такие штаммы не должны оказывать фитотоксическое влияние при инокуляции семян сельскохозяйственных культур [3]. Следует отметить, что совместное применение группы штаммов, в отличии от единичных их видов, будет формировать более устойчивое сообщество микроорганизмов, способное укрепиться в ризосфере, удерживая доминантное положение, оказывая большее влияние при защите культурных растений [4, 5].
Одна из проблем использования биологических препаратов, как на основе консорциума бактерий, так и с единственным биологическим агентом, связана с необходимостью создания условий для хранения препаратов и поиском способов их применения в полевых условиях, которые способствовали бы поддержанию эффективности на уровне, наблюдаемом в лабораторных условиях [6, 7, 8].
В исследованиях по испытанию консорциумов фосфатмобилизующих и диазотрофных бактерий в полевых условиях на пшенице, в рамках которых рассматривали защитный эффект от листовых пятнистостей, вызванных септориозом, и влияние на прорастание семян, был показан синергетический эффект их штаммов [9, 10].
Цель исследования – установить влияние консорциума бактерий, выделенных из ризосферы ячменя, на корневые гнили на модельной системе в лаборатории и на растениях в полевых условиях.
Условия, материалы и методы. Отбор образцов ярового ячменя сорта Камашевский проводили на опытных полях Федерального исследовательского центра «Казанский научный центр РАН», расположенных в Лаишевском районе Республики Татарстан летом 2022 г. После сбора ризосферной почвы c корнями ячменя в 50 мл пробирки их заливали фосфатным буфером (PBS) для получения клеточной суспензии. После серии ее разведений образцы высевали на питательную среду Кинга B (пептон – 10 г/л, глицерин – 10 г/л, K2HPO4 – 1,5 г/л, MgSO4 – 1,5 г/л, агар микробиологический – 20 г/л) в чашки Петри, которые далее инкубировали при 30 ºC в течение 36 ч. Отобранные 150 чистых культур бактерий закладывали на хранение в глицериновый раствор (25 %) при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.
Способность бактерий к подвижности определяли по диаметру распространения штамма от места внесения клеточной суспензии в полужидкий агар Luria-Bertani (LB) (триптон – 10 г/л, NaCl– 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, MgSO4 – 1,5 г/л, агар микробиологический – 4 г/л).
Антагонистическую активность выделенных бактерий проверяли по отношению к Fusarium oxysporum. Для этого на среду potato dextrose agar (PDA) (картофельный отвар – 1 л, декстроза – 20 г/л, агар – 20 г/л) вносили 3 мкл суспензии выделенных штаммов и 3 мкл суспензии спор F. oxysporum. Чашки Петри со средой инкубировали при 30 °C в течение 5 дней. Антагонистическую активность оценивали по величине зоны подавления роста гриба.
Штаммы, проявляющие необходимые свойства в тестах на подвижность и антагонизм, проверяли на способность расти совместно, не подавляя взаимное развитие для составления консорциума. Тест проводили путём нанесения испытуемых штаммов перпендикулярно один другому на средах KingB, PDA, LB. Несовместимость исследуемых штаммов определяли по зонам подавления в местах их соприкосновения. С использованием этого теста был составлен консорциум из 4-х совместимых штаммов.
ДНК из штаммов бактерий, составляющих консорциум, выделяли по стандартному протоколу фенол-хлороформной экстракцией [11]. Реакционная смесь ПЦР объёмом 50 мкл содержала 5 мкл 10× PCR Taqbuffer, 1 мкл смесь dNTP, по 0,5 мкл праймеров 27F (5’-gagtttgatcctggctcag-3’) и 1492R (5’-taccttgttacgactt-3’), 1 мкл ДНК матрицы (100 нг), 0,5 мкл Taq ДНК полимеразы, остаток – свободная от нуклеаз вода. Амплификацию проводили в T100 thermocycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) при следующих параметрах: денатурация при 95 °C 2 мин; 34 цикла при 95 °C по 30 с и 58 °C по 30 с; и 72 °C в течение 1 мин 30 с. Последний цикл проводили при 72 °C в течение 5 мин. Фрагменты ДНК детектировали в 1,5 %-ном электрофорезном агарозном геле и визуализировали на Gel Doc EZ Imager with Image Lab 6.0 software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Для очистки фрагментов ДНК из геля использовали коммерческий набор Cleanup Standard (Eвроген). Очищенные фрагменты 16S ДНК секвенировали методом Сэнгера (Евроген) для видовой идентификации штаммов.
Биоконтроль проводили на модельной системе томат – F. oxysporum. Суспензию спор гриба разводили раствором plant nutrient solution до концентрации 104 КОЕ/мл и пропитывали минеральную вату, которую использовали в качестве субстрата. Семена томатов сорта Белый налив замачивали в суспензии клеток, входящих в консорциум (АЯ53, АЯ146, КЯ2, КЯ9), в соотношении 1:1:1:1. Растения размещали в климатокамере (ООО «Фитотрон») на 14 суток при дневной температуре 25 °С, ночной – 21 °С и влажности воздуха 70 %. После этого оценивали индекс развития корневых гнилей (Disease Index, DI) по шкале, где 0 – здоровые растения; 1 – бурые штрихи на основании стебля или его подземной части, отдельные участки бурого цвета (зоны некроза) на первичных и вторичных корнях, 2 – слегка бурое основание стебля, бурые отдельные корни или значительные их участки, отмирание кончиков корней; 3 – темное с перехватом основание стебля или его подземной части, большая часть корней поражена или отмерла.; 4 – стебель перегнивает и переламывается, начало отмирания растений.
Для выявления фитотоксичности семена ячменя сорта Камашевский инокулировали консорциумом, как и в опыте с биоконтролем, семена высушивали, высевали в грунт и помещали в климатокамеру (Фитотрон) при дневной температуре 25 °С, ночной – 21 °С, влажности воздуха 70 %. Через 14 суток определяли всхожесть, длину корней и надземной части растений.
Полевые испытания проводили на базе Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства. Почва – серая лесная, по гранулометрическому составу тяжелосуглинистая со следующими агрохимическими характеристиками: содержание гумуса – 3,83 %, Nг – 93,3 мг/кг (по Тюрину), P2O5 и K2O (по Мачигину) – соответственно 330 мг/кг и 211,7 мг/кг, pHсол – 6,1.
Отклонения температур от средних многолетних значений за вегетационные периоды 2023–2024 гг. не превышали 3 °С. По количеству осадков 2024 г. оказался более увлажнённым, как по отношению к средним многолетним значениям, так и к 2023 г., который был более засушливым и характеризовался очень сухим июнем (рис. 1).
Рис. 1. Температурный режим и количество осадков в период вегетации ячменя.
Для полевых испытаний изучаемого консорциума микроорганизмов семена ячменя сорта Камашевский обрабатывали в день посева в норме 4 л/т суспензией спор гриба в концентрации 104 КОЕ/мл. Контрольный вариант обрабатывали водой с такой же нормой расхода. Во время уборки отбирали снопы с 1 м2 в 3 повторностях. См. ниже зеленым
Учёт поражения ячменя корневыми гнилями проводили однократно в двух повторностях в межфазный период полные всходы – начало кущения культуры. Для этого в 5 точках отбирали по 10 растений подряд. Всего 100 растений в каждом варианте. Полученные показатели сравнивали с контролем.
Развитие корневых гнилей определяли по 4-х балльной шкале[12], где: 0 – отсутствие признаков болезни; 1 балл – слабое побурение колеоптиле, гипокотиля и корней; 2 балла – сильное побурение гипокотиля с точечными некрозами, переходящие на узел кущения и основание стебля, угнетение развития продуктивных стеблей; 3 балла – сильное побурение гипокотиля с обширными некрозами (трухлявость), побурение узла кущения и основания стебля, резкое снижение продуктивности; 4 балла – гибель или пустоколосость растений. Развитие болезни выражали в процентах, его расчет проводили по формуле:
,
где R – развитие болезни, %; N – общее количество больных и здоровых растений (стеблей, листьев, плодов) в пробе, шт.; ∑ а × b – сумма произведений числа больных растений (а) на соответствующий им балл поражения (b), штук × балл; К – высший балл учетной шкалы (К= 4).
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета статистических программ OriginLab pro SR1 b9.5.1.195. Достоверную разницу между группами анализировали с использованием одностороннего ANOVA и апостериорного теста Тьюки при p <0,05.
Результаты и обсуждение. Из 150 выделенных штаммов бактерий подвижность (рис. 2А) проявляли 4 изолята (КЯ1, КЯ2, КЯ9, КЯ10), а антагонизм по отношению к F. oxysporum (рис. 2Б) – 6 штаммов (АЯ53, АЯ73, АЯ74, АЯ114, АЯ130, АЯ146), которые были отобраны в качестве кандидатов на составление консорциума. Поскольку штаммы, обладавшие антагонистической активностью, не проявляли подвижности на чашечных тестах, а штаммы бактерий, обладающие подвижностью, не проявляли антагонизма к F. oxysporum консорциум составляли из двух подвижных штаммов и двух штаммов, проявляющих антагонизм.
Тест на совместимость (рис. 2В) проводили для всех штаммов, проявляющих свойства подвижности и антагонизма к F. oxysporum. Единственная комбинация, в которой не наблюдали взаимного подавления, состояла из штаммов АЯ53, АЯ146, КЯ2, КЯ9, которые вошли в испытуемый консорциум.
По результатам секвенирования 16S ДНК изолят АЯ53 отнесен к виду Paenibacillus pabuli, АЯ146 – Bacillus pumilus, КЯ2 – Pseudomonas koreensis, КЯ9 – Pseudomonas frederiksbergensis.
Рис. 2 – Тесты штаммов консорциума на подвижность (А), антагонизм (Б), совместимость (В).
При испытании консорциума на способность сдерживать развитие корневой гнили томатов в контрольном варианте без патогена и изучаемых микроорганизмов все растения на момент учёта были здоровы (рис. 3а). В варианте со спорами F. oxysporum все растения к этому времени были поражены, в том числе 19 из них погибли (DI4), а остальные проявляли признаки, предшествующие гибели растений (DI3). При внесении вместе со спорами F. oxysporum консорциума микроорганизма, несмотря на отсутствие полностью здоровых побегов, только у 4 растений отмечен индексом развития корневых гнилей DI4, у 32 растений наблюдали только начальные симптомы заболевания (DI1, DI2). Развитие заболевания на инфекционном фоне составляло 85 %, а в варианте с консорциумом микроорганизмов оно было на 31 % меньше.
|
а) |
б) |
Рис. 3 – Индекс развития корневых гнилей (DI) на томатах (а, цифрами указано число растений с соответствующим индексом развития) и длина корневой системы и надземной частей ячменя (б, см).
.
Изучаемый консорциум микроорганизмов не оказывал влияния на рост надземной и подземной частей ячменя (рис. 3б), то есть фитотоксический эффекта отсутствовал.
В полевых условиях корневые гнили были отмечены в обоих вариантах (рис. 4). При этом развитие заболевания в фазе начала кущения в 2023 г. в контроле было выше, чем в экспериментальном варианте, на 8,1 % (НСР05 2,3 %) в 2024 г.– на 5,6 % (НСР05 – 5 %).
Рис. 4 – Развитие корневых гнилей на яровом ячмене
*различия с контролем достоверны при p <0,05), %.
Несмотря на влияние на корневые гнили, при уборке различий между контрольным и опытным вариантами по числу растений, стеблей и колосьев с 1 м2, а также по параметры длины колосьев и стеблей были статистически незначимы (см. табл.). Существенные различия отмечали только по массе стеблей и урожайности в 2023 г. В контроле величины этих показателей были равны соответственно 300 г/м2 и 41,5 ц/га, а в опытном варианте – выше на 85,8 г/м2 (НСР05 – 82 г/м2) и 7,9 ц/га (НСР05 – 6,3 ц/га).
Таблица – Биометрические показатели ярового ячменя при обработке консорциумом бактерий
|
Признак |
Контроль |
Консорциум |
||
|
2023 г. |
2024 г. |
2023 г. |
2024 г. |
|
|
Число растений, шт./м2 |
500 |
520 |
489 |
505 |
|
Число стеблей, шт./м2 |
661 |
680 |
733 |
700 |
|
Число колосьев, шт./м2 |
641 |
630 |
705 |
652 |
|
Длина колоса, см |
4,9 |
5,0 |
5,3 |
5,1 |
|
Длина стебля, см |
52 |
53 |
55 |
53 |
|
Масса стеблей, г/м2 |
300 |
340 |
385* |
345 |
|
Урожайность, ц/га |
41,5 |
43 |
49,4* |
44,5 |
*различия с контролем достоверные при p <0,05.
Результаты исследований демонстрируют неоднозначное поведение изученного консорциума микроорганизмов в полевых опытах. Он способен подавлять развитие корневых гнилей, однако согласно результатам анализа других биометрических показателей не подтверждено влияние этого эффекта на развитие растений ячменя на естественном инфекционном фоне. Можно предположить, что эффект, оказываемый бактериальным консорциумом, был непродолжительным. Корневая зона могла быть замещена прежней микрофлорой, которая подавила развитие внесённых бактерий на более поздних стадиях развития ячменя. Кроме того, по всей видимости, корневые гнили развивались недостаточно интенсивно, чтобы удалось увидеть эффект от снижения развития заболевания в оба года.
Выводы. Консорциум бактерий, выделенных из ризосферы ячменя, способен достоверно сдерживать развитие корневых гнилей как в лабораторных условиях у томатов (на 31 %), так и в полевых условиях у ячменя (на 5,6…8,1 %). При этом он не оказывает фитотоксического влияния на растения ячменя.
В 2023 г. урожайность в варианте с обработкой семян ячменя сконструированным консорциумом превышала контроль на 7,9 ц/га при НСР05 – 6,3 ц/га. 2024 г. значимых изменений биометрических показателях развития растений не регистрировали. Таким образом, поведение рассматриваемого консорциума микроорганизмов в полевых условиях не было однозначным. Хотя он может замедлять развитие корневых гнилей, однако этот эффект не оказывает влияние на развития самих растений ячменя в условиях естественного инфекционного фона.
1. Baturo A. Effect of thermotherapy, grain treatment and leaf spraying with biological control agents on spring barley (Hordeum vulgare) health in organic system. Phytopathol. Pol. 2006; Vol.41. 15-26 p.
2. Ryabtseva NA. [Barley responsiveness to biopreparations]. Agrarnaya nauka. 2021; Vol.344. 5. 51-55 p. doi:https://doi.org/10.32634/0869-8155-2021-349-5-51-55.
3. Maslienko LV, Kurilova DA, Shipievskaya EYu. [Effect of laboratory samples of biopreparations based on promising strains of phytopathogen antagonists on soybean seedlings]. Maslichnue kultury. 2010; 1 (142-143). 104-108 p.
4. Yang W, Zheng L, Liu HX. Evaluation of the effectiveness of a consortium of three plant-growth promoting rhizobacteria for biocontrol of cotton Verticillium wilt. Biocontrol science and technology. 2014; Vol.24. 5. 489-502 p. doi:https://doi.org/10.1080/09583157.2013.873389.
5. Asyakina LK, Mudgal G, Tikhonov SL. [Study of the potential of natural microbiota of spring soft wheat in increasing crop yields]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2023; Vol.37. 11. 12-17 p.
6. Nunes PS, Junior GVL, Mascarin GM. Microbial consortium of biological products: do they have a future? [Internet]. Biological Control. 2024; Article 105439. [cited 2024, August 15]. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104996442400001X. doi:https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2024.105439.
7. Byrne MB, Thapa G, Doohan FM. Lactic acid bacteria as potential biocontrol agents for Fusarium head blight disease of spring barley. [Internet]. Frontiers in Microbiology. 2022; Vol.13. Article 912632. [cited 2024, September 05]. Available from: https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2022.912632/full. doi:https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.912632
8. Khomyak AI, Zhevnova NA, Allakhverdyan VV. [Selection of adhesives for joint use with a laboratory sample of a biological product in agriculture]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2023; Vol.37. 8. 53-58 p.
9. Koshpaeva TV, Minikaev DT, Degtyareva IA. [Efficiency of bacterial strains native to Tatarstan soils and Azolen biopreparation in biotesting on spring wheat]. Agrokhimicheskiy vestnik. 2021; 6. 73-77 p.
10. Burkhanova GF, Veselova SV, Sorokan AV. [Bacillus bacteria in the regulation of wheat resistance to Septoria nodorum Berk]. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2017; Vol.53. 3. 308-315 p.
11. Green MR, Sambrook J. Isolation of high-molecular-weight DNA using organic solvents. Cold Spring Harbor Protocols. 2017; 4. 356-359 p. doi:https://doi.org/10.1101/pdb.prot093450.
12. Sanin SS, Cherkashin VI, Nazarova LN. Fitosanitarnaya ekspertiza zernovykh kultur (bolezni rasteniy): rekomendatsii. [Phytosanitary examination of grain crops (plant diseases): recommendations]. Moscow: FGNU “Rosinformagrotekh”. 2002; 133-156 p.
