Казань, Россия
УДК 632.9 Борьба с болезнями и вредителями растений
Реферат. Исследования проводили с целью определения защитного эффекта, который демонстрирует консорциум бактерий, выделенных из ризосферы ячменя, против корневых гнилей. Работу выполняли на модельной системе в лаборатории и на растениях ячменя в полевых условиях. В лабораторных условиях консорциум был проверен на отсутствие фитотоксичности в отношении растений ярового ячменя и на способность сдерживать развитие корневых гнилей на модельной системе томат-Fusarium oxysporum, где было продемонстрировано снижение развития заболевания на 31%, по сравнению с контролем. Полевые испытания выполняли в 2023– 2024 года в Республике Татарстан. Почва – серая лесная тяжелосуглинистая. Для полевых испытаний консорциума семена ячменя сорта Камашевский обрабатывали в день посева в норме 4 л/т суспензией спор гриба в концентрации 104 КОЕ/мл. Корневые гнили отмечали как в контроле, так и в опытном варианте – развитие заболевания в 2023 году достигало 17,1% и 9% соответственно, в 2024 году – 12,6% и 7%. Несмотря на влияние на корневые гнили, различия между величинами биометрических показателей были статистически незначимыми. Урожайность в 2023 году в контрольном варианте составляла 41,5 ц/га, в опытном она была достоверно выше на 7,9 ц/га (НСР05 – 6,3 ц/га). В 2024 году существенных различий между опытным и контрольным вариантами не наблюдали, урожайность составляла 43,0…44,5 ц/га с меньшей величиной этого показателя в контроле. Таким образом, консорциум бактерий из ризосферы ярового ячменя способен сдерживать развитие корневых гнилей, не оказывая токсического влияния на растения.
ячмень, корневые гнили, фитотоксичность, консорциум микроорганизмов, защита растений.
Альтернативу химической обработки для культурных растений, основной запас фитопатогенной микрофлоры которых находится на семенах и в почве, давно пытаются реализовать с помощью бактериальных штаммов, активно колонизирующих растительные ткани или их поверхности и способных ограничивать развитие в этой нише фитопатогенов, в частности корневых гнилей и возбудителей пятнистостей ячменя [1, 2]. При этом такие штаммы не должны оказывать фитотоксическое влияние при инокуляции семян сельскохозяйственных культур [3]. Следует отметить, что совместное применение группы штаммов, в отличии от единичных их видов, будет формировать более устойчивое сообщество микроорганизмов, способное укрепиться в ризосфере, удерживая доминантное положение, оказывая большее влияние при защите культурных растений [4, 5].
Одна из проблем использования биологических препаратов, как на основе консорциума бактерий, так и с единственным биологическим агентом, связана с необходимостью создания условий для хранения препаратов и поиском способов их применения в полевых условиях, которые способствовали бы поддержанию эффективности на уровне, наблюдаемом в лабораторных условиях [6, 7, 8].
В исследованиях по испытанию консорциумов фосфатмобилизующих и диазотрофных бактерий в полевых условиях на пшенице, в рамках которых рассматривали защитный эффект от листовых пятнистостей, вызванных септориозом, и влияние на прорастание семян, был показан синергетический эффект их штаммов [9, 10].
Цель исследования – установить влияние консорциума бактерий, выделенных из ризосферы ячменя, на корневые гнили на модельной системе в лаборатории и на растениях в полевых условиях.
Условия, материалы и методы. Отбор образцов ярового ячменя сорта Камашевский проводили на опытных полях Федерального исследовательского центра «Казанский научный центр РАН», расположенных в Лаишевском районе Республики Татарстан летом 2022 г. После сбора ризосферной почвы c корнями ячменя в 50 мл пробирки их заливали фосфатным буфером (PBS) для получения клеточной суспензии. После серии ее разведений образцы высевали на питательную среду Кинга B (пептон – 10 г/л, глицерин – 10 г/л, K2HPO4 – 1,5 г/л, MgSO4 – 1,5 г/л, агар микробиологический – 20 г/л) в чашки Петри, которые далее инкубировали при 30 ºC в течение 36 ч. Отобранные 150 чистых культур бактерий закладывали на хранение в глицериновый раствор (25 %) при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.
Способность бактерий к подвижности определяли по диаметру распространения штамма от места внесения клеточной суспензии в полужидкий агар Luria-Bertani (LB) (триптон – 10 г/л, NaCl– 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, MgSO4 – 1,5 г/л, агар микробиологический – 4 г/л).
Антагонистическую активность выделенных бактерий проверяли по отношению к Fusarium oxysporum. Для этого на среду potato dextrose agar (PDA) (картофельный отвар – 1 л, декстроза – 20 г/л, агар – 20 г/л) вносили 3 мкл суспензии выделенных штаммов и 3 мкл суспензии спор F. oxysporum. Чашки Петри со средой инкубировали при 30 °C в течение 5 дней. Антагонистическую активность оценивали по величине зоны подавления роста гриба.
Штаммы, проявляющие необходимые свойства в тестах на подвижность и антагонизм, проверяли на способность расти совместно, не подавляя взаимное развитие для составления консорциума. Тест проводили путём нанесения испытуемых штаммов перпендикулярно один другому на средах KingB, PDA, LB. Несовместимость исследуемых штаммов определяли по зонам подавления в местах их соприкосновения. С использованием этого теста был составлен консорциум из 4-х совместимых штаммов.
ДНК из штаммов бактерий, составляющих консорциум, выделяли по стандартному протоколу фенол-хлороформной экстракцией [11]. Реакционная смесь ПЦР объёмом 50 мкл содержала 5 мкл 10× PCR Taqbuffer, 1 мкл смесь dNTP, по 0,5 мкл праймеров 27F (5’-gagtttgatcctggctcag-3’) и 1492R (5’-taccttgttacgactt-3’), 1 мкл ДНК матрицы (100 нг), 0,5 мкл Taq ДНК полимеразы, остаток – свободная от нуклеаз вода. Амплификацию проводили в T100 thermocycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) при следующих параметрах: денатурация при 95 °C 2 мин; 34 цикла при 95 °C по 30 с и 58 °C по 30 с; и 72 °C в течение 1 мин 30 с. Последний цикл проводили при 72 °C в течение 5 мин. Фрагменты ДНК детектировали в 1,5 %-ном электрофорезном агарозном геле и визуализировали на Gel Doc EZ Imager with Image Lab 6.0 software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Для очистки фрагментов ДНК из геля использовали коммерческий набор Cleanup Standard (Eвроген). Очищенные фрагменты 16S ДНК секвенировали методом Сэнгера (Евроген) для видовой идентификации штаммов.
Биоконтроль проводили на модельной системе томат – F. oxysporum. Суспензию спор гриба разводили раствором plant nutrient solution до концентрации 104 КОЕ/мл и пропитывали минеральную вату, которую использовали в качестве субстрата. Семена томатов сорта Белый налив замачивали в суспензии клеток, входящих в консорциум (АЯ53, АЯ146, КЯ2, КЯ9), в соотношении 1:1:1:1. Растения размещали в климатокамере (ООО «Фитотрон») на 14 суток при дневной температуре 25 °С, ночной – 21 °С и влажности воздуха 70 %. После этого оценивали индекс развития корневых гнилей (Disease Index, DI) по шкале, где 0 – здоровые растения; 1 – бурые штрихи на основании стебля или его подземной части, отдельные участки бурого цвета (зоны некроза) на первичных и вторичных корнях, 2 – слегка бурое основание стебля, бурые отдельные корни или значительные их участки, отмирание кончиков корней; 3 – темное с перехватом основание стебля или его подземной части, большая часть корней поражена или отмерла.; 4 – стебель перегнивает и переламывается, начало отмирания растений.
Для выявления фитотоксичности семена ячменя сорта Камашевский инокулировали консорциумом, как и в опыте с биоконтролем, семена высушивали, высевали в грунт и помещали в климатокамеру (Фитотрон) при дневной температуре 25 °С, ночной – 21 °С, влажности воздуха 70 %. Через 14 суток определяли всхожесть, длину корней и надземной части растений.
Полевые испытания проводили на базе Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства. Почва – серая лесная, по гранулометрическому составу тяжелосуглинистая со следующими агрохимическими характеристиками: содержание гумуса – 3,83 %, Nг – 93,3 мг/кг (по Тюрину), P2O5 и K2O (по Мачигину) – соответственно 330 мг/кг и 211,7 мг/кг, pHсол – 6,1.
Отклонения температур от средних многолетних значений за вегетационные периоды 2023–2024 гг. не превышали 3 °С. По количеству осадков 2024 г. оказался более увлажнённым, как по отношению к средним многолетним значениям, так и к 2023 г., который был более засушливым и характеризовался очень сухим июнем (рис. 1).
Рис. 1. Температурный режим и количество осадков в период вегетации ячменя.
Для полевых испытаний изучаемого консорциума микроорганизмов семена ячменя сорта Камашевский обрабатывали в день посева в норме 4 л/т суспензией спор гриба в концентрации 104 КОЕ/мл. Контрольный вариант обрабатывали водой с такой же нормой расхода. Во время уборки отбирали снопы с 1 м2 в 3 повторностях. См. ниже зеленым
Учёт поражения ячменя корневыми гнилями проводили однократно в двух повторностях в межфазный период полные всходы – начало кущения культуры. Для этого в 5 точках отбирали по 10 растений подряд. Всего 100 растений в каждом варианте. Полученные показатели сравнивали с контролем.
Развитие корневых гнилей определяли по 4-х балльной шкале[12], где: 0 – отсутствие признаков болезни; 1 балл – слабое побурение колеоптиле, гипокотиля и корней; 2 балла – сильное побурение гипокотиля с точечными некрозами, переходящие на узел кущения и основание стебля, угнетение развития продуктивных стеблей; 3 балла – сильное побурение гипокотиля с обширными некрозами (трухлявость), побурение узла кущения и основания стебля, резкое снижение продуктивности; 4 балла – гибель или пустоколосость растений. Развитие болезни выражали в процентах, его расчет проводили по формуле:
,
где R – развитие болезни, %; N – общее количество больных и здоровых растений (стеблей, листьев, плодов) в пробе, шт.; ∑ а × b – сумма произведений числа больных растений (а) на соответствующий им балл поражения (b), штук × балл; К – высший балл учетной шкалы (К= 4).
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета статистических программ OriginLab pro SR1 b9.5.1.195. Достоверную разницу между группами анализировали с использованием одностороннего ANOVA и апостериорного теста Тьюки при p <0,05.
Результаты и обсуждение. Из 150 выделенных штаммов бактерий подвижность (рис. 2А) проявляли 4 изолята (КЯ1, КЯ2, КЯ9, КЯ10), а антагонизм по отношению к F. oxysporum (рис. 2Б) – 6 штаммов (АЯ53, АЯ73, АЯ74, АЯ114, АЯ130, АЯ146), которые были отобраны в качестве кандидатов на составление консорциума. Поскольку штаммы, обладавшие антагонистической активностью, не проявляли подвижности на чашечных тестах, а штаммы бактерий, обладающие подвижностью, не проявляли антагонизма к F. oxysporum консорциум составляли из двух подвижных штаммов и двух штаммов, проявляющих антагонизм.
Тест на совместимость (рис. 2В) проводили для всех штаммов, проявляющих свойства подвижности и антагонизма к F. oxysporum. Единственная комбинация, в которой не наблюдали взаимного подавления, состояла из штаммов АЯ53, АЯ146, КЯ2, КЯ9, которые вошли в испытуемый консорциум.
По результатам секвенирования 16S ДНК изолят АЯ53 отнесен к виду Paenibacillus pabuli, АЯ146 – Bacillus pumilus, КЯ2 – Pseudomonas koreensis, КЯ9 – Pseudomonas frederiksbergensis.
Рис. 2 – Тесты штаммов консорциума на подвижность (А), антагонизм (Б), совместимость (В).
При испытании консорциума на способность сдерживать развитие корневой гнили томатов в контрольном варианте без патогена и изучаемых микроорганизмов все растения на момент учёта были здоровы (рис. 3а). В варианте со спорами F. oxysporum все растения к этому времени были поражены, в том числе 19 из них погибли (DI4), а остальные проявляли признаки, предшествующие гибели растений (DI3). При внесении вместе со спорами F. oxysporum консорциума микроорганизма, несмотря на отсутствие полностью здоровых побегов, только у 4 растений отмечен индексом развития корневых гнилей DI4, у 32 растений наблюдали только начальные симптомы заболевания (DI1, DI2). Развитие заболевания на инфекционном фоне составляло 85 %, а в варианте с консорциумом микроорганизмов оно было на 31 % меньше.
|
а) |
б) |
Рис. 3 – Индекс развития корневых гнилей (DI) на томатах (а, цифрами указано число растений с соответствующим индексом развития) и длина корневой системы и надземной частей ячменя (б, см).
.
Изучаемый консорциум микроорганизмов не оказывал влияния на рост надземной и подземной частей ячменя (рис. 3б), то есть фитотоксический эффекта отсутствовал.
В полевых условиях корневые гнили были отмечены в обоих вариантах (рис. 4). При этом развитие заболевания в фазе начала кущения в 2023 г. в контроле было выше, чем в экспериментальном варианте, на 8,1 % (НСР05 2,3 %) в 2024 г.– на 5,6 % (НСР05 – 5 %).
Рис. 4 – Развитие корневых гнилей на яровом ячмене
*различия с контролем достоверны при p <0,05), %.
Несмотря на влияние на корневые гнили, при уборке различий между контрольным и опытным вариантами по числу растений, стеблей и колосьев с 1 м2, а также по параметры длины колосьев и стеблей были статистически незначимы (см. табл.). Существенные различия отмечали только по массе стеблей и урожайности в 2023 г. В контроле величины этих показателей были равны соответственно 300 г/м2 и 41,5 ц/га, а в опытном варианте – выше на 85,8 г/м2 (НСР05 – 82 г/м2) и 7,9 ц/га (НСР05 – 6,3 ц/га).
Таблица – Биометрические показатели ярового ячменя при обработке консорциумом бактерий
|
Признак |
Контроль |
Консорциум |
||
|
2023 г. |
2024 г. |
2023 г. |
2024 г. |
|
|
Число растений, шт./м2 |
500 |
520 |
489 |
505 |
|
Число стеблей, шт./м2 |
661 |
680 |
733 |
700 |
|
Число колосьев, шт./м2 |
641 |
630 |
705 |
652 |
|
Длина колоса, см |
4,9 |
5,0 |
5,3 |
5,1 |
|
Длина стебля, см |
52 |
53 |
55 |
53 |
|
Масса стеблей, г/м2 |
300 |
340 |
385* |
345 |
|
Урожайность, ц/га |
41,5 |
43 |
49,4* |
44,5 |
*различия с контролем достоверные при p <0,05.
Результаты исследований демонстрируют неоднозначное поведение изученного консорциума микроорганизмов в полевых опытах. Он способен подавлять развитие корневых гнилей, однако согласно результатам анализа других биометрических показателей не подтверждено влияние этого эффекта на развитие растений ячменя на естественном инфекционном фоне. Можно предположить, что эффект, оказываемый бактериальным консорциумом, был непродолжительным. Корневая зона могла быть замещена прежней микрофлорой, которая подавила развитие внесённых бактерий на более поздних стадиях развития ячменя. Кроме того, по всей видимости, корневые гнили развивались недостаточно интенсивно, чтобы удалось увидеть эффект от снижения развития заболевания в оба года.
Выводы. Консорциум бактерий, выделенных из ризосферы ячменя, способен достоверно сдерживать развитие корневых гнилей как в лабораторных условиях у томатов (на 31 %), так и в полевых условиях у ячменя (на 5,6…8,1 %). При этом он не оказывает фитотоксического влияния на растения ячменя.
В 2023 г. урожайность в варианте с обработкой семян ячменя сконструированным консорциумом превышала контроль на 7,9 ц/га при НСР05 – 6,3 ц/га. 2024 г. значимых изменений биометрических показателях развития растений не регистрировали. Таким образом, поведение рассматриваемого консорциума микроорганизмов в полевых условиях не было однозначным. Хотя он может замедлять развитие корневых гнилей, однако этот эффект не оказывает влияние на развития самих растений ячменя в условиях естественного инфекционного фона.
1. Baturo A. Effect of thermotherapy, grain treatment and leaf spraying with biological control agents on spring barley (Hordeum vulgare) health in organic system // Phytopathol. Pol. 2006. Vol. 41. P. 15–26.
2. Рябцева Н. А. Отзывчивость ячменя на биопрепараты // Аграрная наука. 2021. Т. 344. №. 5. С. 51–55. doi:https://doi.org/10.32634/0869-8155-2021-349-5-51-55.
3. Влияние лабораторных образцов биопрепаратов на основе перспективных штаммов антагонистов фитопатогенов на проростки сои / Л. В. Маслиенко, Д. А. Курилова, Е. Ю. Шипиевская и др. // Масличные культуры. 2010. №. 1 (142-143). С. 104–108.
4. Evaluation of the effectiveness of a consortium of three plant-growth promoting rhizobacteria for biocontrol of cotton Verticillium wilt / W. Yang, L. Zheng, H. X. Liu, et al. // Biocontrol science and technology. 2014. Vol. 24. No. 5. P. 489–502. doi:https://doi.org/10.1080/09583157.2013.873389.
5. Исследование потенциала естественной микробиоты яровой мягкой пшеницы в повышении урожайности / Л.К. Асякина, G. Mudgal, С.Л. Тихонов и др. // Достижения науки и техники АПК. 2023. Т. 37. № 11. С. 12-17
6. Microbial consortium of biological products: do they have a future? / P. S. Nunes, G. V. L. Junior, G. M. Mascarin, et al // Biological Control. 2024. Article 105439. URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104996442400001X (дата обращения: 15.08.2024). doi:https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2024.105439.
7. Lactic acid bacteria as potential biocontrol agents for Fusarium head blight disease of spring barley / M. B. Byrne, G. Thapa, F. M. Doohan, et al. // Frontiers in Microbiology. 2022. Vol. 13. Article 912632. URL: https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2022.912632/full. (дата обращения: 05.09.2024). doi:https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.912632
8. Подбор прилипателей для совместного применения с лабораторным образцом биопрепарата в сельском хозяйстве / А.И. Хомяк, Н.А. Жевнова, В.В. Аллахвердян и др. // Достижения науки и техники АПК. 2023. Т. 37. № 8. С. 53-58.
9. Кошпаева Т. В., Миникаев Д. Т., Дегтярева И. А. Эффективность действия штаммов бактерий, аборигенных для почв татарстана, и биопрепарата азолен при биотестировании на яровой пшенице // Агрохимический вестник. 2021. № 6. С. 73–77.
10. Бактерии рода Bacillus в регуляции устойчивости пшеницы к Septoria nodorum Berk / Г. Ф. Бурханова, С. В. Веселова, A. В. Сорокань и др. // Прикладная биохимия и микробиология.2017.Т.53.№ 3.С.308–315.
11. Green M. R., Sambrook J. Isolation of high-molecular-weight DNA using organic solvents // Cold Spring Harbor Protocols. 2017. No. 4. P. 356–359. doi:https://doi.org/10.1101/pdb.prot093450.
12. Фитосанитарная экспертиза зерновых культур (болезни растений): рекомендации / С. С. Санин, В. И. Черкашин, Л. Н. Назарова и др. М.: ФГНУ «Росинформагротех. 2002. С. 133–156.
