РАЗРАБОТКА СЕЛЕКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИТАТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ DRIGALSKI LACTOSE AGAR
Аннотация и ключевые слова
Аннотация (русский):
Цель исследований − совершенствование селективной добавки к элективным средам для выделения энтеробактерий. Задачи исследований − выявить чувствительность выделенных штаммов энтеробактерий к антибиотикам; разработать новую селективную добавку с антибиотиками к питательной среде Drigalski Lactose Agar. Среды должны иметь рецептуру, оптимально обеспечивающую рост и размножение микроорганизмов определённого вида или семейства. Интенсивное развитие био-технологии и микробиологии позволяет сегодня разрабатывать новые питательные среды и модифицировать уже имеющиеся рецептуры сред. Объект исследования – новая селективная добавка с антибиотиками к питательной среде Drigalski Lactose Agar. Материал для исследований – 253 изолята бактерий, выделенных из кишечного микробиотопа различных видов животных. Исследование проводили в период с 2010 по 2017 гг. Наибольшую антимикробную активность в отношении всех выделенных культур энтеробактерий проявляли карбенициллин 30±2,3 из группы карбоксипенициллинов и пиперациллин 37±2,5 из группы уреидопенициллинов, канамицин 24±1,5, амикацин 26±1,7 и гентамицин 25±0,8, цефепим 38±3,2 из группы цефалоспоринов IV поколения, тетрациклин 28±1,6, доксициклин 34±2,3 и хлорамфеникол 31±2,5, налидиксовая кислота 37±2,8, триметоприм 35±3,4. Высокую устойчивость энтеробактерии проявляли к бензилпенициллину из группы естественных пенициллинов, к стрептомицину, це-фалотину из группы цефалоспоринов I поколения, к полимиксину В, к офлоксацину (таривид) и метрони-дазолу. В ходе выбора селективных компонентов рассматривали антибактериальные препараты, эффективные в отношении сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Бы-ли выбраны из группы гликопептидов ванкомицин, из группы оксазолидинонов линезолид, из группы кетолидов телитромицин. В состав разработанной селективной добавки к среде Drigalski Lactose Agar введены антибиотики ванкомицин и телитромицин в дозе 0,008 г/дм3, линезолид 0,004 г/дм3 среды.

Ключевые слова:
антибиотики, среда, добавка, питательная, селективная
Текст
Текст произведения (PDF): Читать Скачать

Совершенствование средств оценки показателей микробиоценоза животных, диагностики, профилактики, лечения незаразных и инфекционных болезней является наиболее значимой задачей, стоящей на сегодняшний день перед ветеринарными специалистами, микробиологами и биотехнологами. Одним из важных элементов в лабораторной диагностике инфекционных болезней является выделение возбудителя в чистой культуре на питательных средах [6, 7, 8].

Среды должны иметь рецептуру, оптимально обеспечивающую рост и размножение микроорганизмов определённого вида или семейства. Интенсивное развитие биотехнологии и микробиологии позволяет сегодня разрабатывать новые питательные среды и модифицировать уже имеющиеся рецептуры сред [1, 2, 3, 4, 5].

В связи с этим, конструирование и производство качественных питательных сред, разработка рецептур новых микробиологических сред и совершенствование уже применяемых сред одно из важных направлений работы в области биотехнологии, медицинской и ветеринарной микробиологии [6, 7, 8, 9].

Цель исследований – совершенствование селективной добавки к элективным средам для выделения энтеробактерий.  

Задачи исследований − выявить чувствительность выделенных штаммов энтеробактерий к антибиотикам; разработать новую селективную добавку с антибиотиками к питательной среде Drigalski Lactose Agar.

Материал и методы исследования. Объект исследований – новая селективная добавка с антибиотиками к питательной среде Drigalski Lactose Agar. Материал для исследований – 253 изолята бактерий, выделенных из кишечного микробиотопа различных видов животных. Исследования проводили в период с 2010 по 2017 гг.

Суспензию биоматериала для получения роста культур энтеробактерий высевали на дифференциально-диагностические и селективно-элективные питательные среды.  Суспензию материала распределяли одноразовым стерильным микробиологическим г-образным шпателем по поверхности среды в чашке Петри и инкубировали в термостате при 25-300С,  370С  48-72 ч [10]. Чистые культуры микроорганизмов идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, серологическим свойствам. Количество выросших колоний микроорганизмов (КОЕ – колониеобразующая единица) на плотных питательных средах проводили общепринятым методом на приборе ПСБ (прибор счёта бактерий).

Определение чувствительности выделенных нами от различных животных изолятов энтерорбактеий к антимикробным препаратам проводили диско-диффузионным методом на среде АГВ и агаре Мюллера-Хинтона. Подбор антибиотиков и создание селективной добавки с антибиотиками к среде Drigalski Lactose Agar осуществляли методом серийных разведений в бульоне МПБ и на Эндо агаре.

Результаты исследований обрабатывали статистически по общепринятой методике с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.

Результаты исследований. В процессе разработки новой селективной добавки к питательной среде Drigalski Lactose Agar выявлялась чувствительность энтеробактерий к антимикробным препаратам.

Результаты определения антибиотикочувствительности энтеробактерий к пенициллинам (ампициллин № 1, бензилпенициллин № 2, амоксициллин № 3, карбенициллин № 4 и пиперациллин № 5) и аминогликозидам посредством постановки диско-диффузионного теста представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Антибиотикочувствительность энтеробактерий к пенициллинам 

Чистая культура

энтеробактерий

Пенициллины (значение зоны ингибиции роста (мм))

№ 1

№ 2

№ 3

№ 4

№ 4

Escherichia coli

16±0,2

8±0,1

17±0,4

22±0,5

21±0,6

Shigella dysenteriae

18±0,4

3±0,07

18±0,6

23±0,8

22±0,5

Shigella flexneri

19±0,6

2±0,05

19±0,7

25±0,5

21±0,9

Salmonella Enteritidis

18±0,4

3±0,06

17±0,9

24±0,7

23±0,8

Klebsiella oxytoca

20±1,6

3±0,04

21±0,8

24±0,9

25±0,7

Proteus vulgaris

17±1,3

0,7±0,08

20±1,2

26±1,6

28±1,4

Providencia alcalifaciens

15±0,4

1±0,04

18±1,4

22±1,8

20±1,2

Hafnia alvei

20±1,8

0,4±0,3

19±1,5

25±1,8

28±1,7

Morganella morganii

18±2,5

0,5±0,06

20±1,3

23±1,6

27±1,5

Enterobacter cloacae

22±1,5

0,8±0,2

22±1,4

28±1,8

24±2,3

Citrobacter freundii

22±0,8

4±0,1

21±1,2

25±1,6

33±2,2

Serratia marcescens

18±0,4

2±0,08

17±1,5

21±1,4

23±1,8

Erwinia amylovora

24±3,8

0,4±0,05

28±1,7

30±2,3

37±2,5

Kluyvera cryocrescens

17±1,3

0,5±0,07

16±1,8

21±1,5

24±2,0

Yersinia enterocolitica

3±0,4

5±0,06

15±0,8

21±1,2

23±1,3

 

Таблица 2

Антибиотикочувствительность энтеробактерий к аминогликозидам 

Чистая культура

энтеробактерий

Аминогликозиды (значение зоны ингибиции роста (мм))

стрептомицин

канамицин

амикацин

гентамицин

Escherichia coli

16±0,2

17±0,1

18±0,4

15±0,3

Shigella dysenteriae

19±0,7

22±0,8

24±1,2

20±0,6

Shigella flexneri

17±0,9

24±1,5

20±1,4

22±1,3

Salmonella Enteritidis

15±0,5

19±0,6

22±1,6

18±0,2

Klebsiella oxytoca

19±1,7

23±1,5

18±0,9

25±2,3

Proteus vulgaris

17±1,6

20±1,3

17±1,3

23±2,8

Providencia alcalifaciens

18±1,2

19±0,8

26±1,7

21±2,2

Hafnia alvei

18±1,2

19±1,7

21±1,4

22±2,6

Morganella morganii

19±1,8

22±2,6

19±1,6

23±3,2

Enterobacter cloacae

19±1,4

22±1,2

23±1,7

20±1,3

Citrobacter freundii

16±0,8

17±0,9

20±0,8

19±0,5

Serratia marcescens

18±0,3

19±0,5

17±1,6

20±0,8

Erwinia amylovora

22±2,4

24±4,2

22±1,4

19±2,6

Kluyvera cryocrescens

15±1,2

19±0,7

26±1,8

22±1,6

Yersinia enterocolitica

10±0,3

23±0,7

16±1,2

25±0,8

 

Наибольшую антимикробную активность в отношении всех выделенных культур энтеробактерий проявляли карбенициллин из группы карбоксипенициллинов и пиперациллин из группы уреидопенициллинов, канамицин, амикацин и гентамицин. Высокую устойчивость энтеробактерии проявляли к бензилпенициллину из группы естественных пенициллинов и к стрептомицину.

Результаты определения антибиотикочувствительности энтеробактерий к цефалоспоринам (цефалотин № 1, цефтриаксон (лонгацеф) № 2, цефотаксим (клафоран) № 3, цефепим № 4, цефозопран № 5 и цефквин № 6) в результате постановки диско-диффузионного теста представлены в таблице 3. Результаты определения чувствительности энтеробактерий к к тетрациклину представлены в таблице 4.

Таблица 3

Антибиотикочувствительность энтеробактерий к цефалоспоринам

Чистая культура
энтеробактерий

Цефалоспорины (значение зоны ингибиции роста (мм))

№ 1

№ 2

№ 3

№ 4

№ 5

№ 6

Escherichia coli

10±0,5

21±1,2

23±1,7

25±1,9

23±1,6

22±1,5

Shigella dysenteriae

12±0,8

16±1,5

18±0,9

23±2,2

21±1,2

20±1,2

Shigella flexneri

10±1,3

17±0,9

19±1,8

24±1,4

20±1,3

19±0,7

Salmonella Enteritidis

12±0,9

18±1,7

18±0,6

26±1,7

18±0,9

18±0,5

Klebsiella oxytoca

8±0,5

20±1,9

17±1,3

32±2,3

25±1,7

23±1,9

Proteus vulgaris

10±1,5

17±0,7

22±2,5

26±1,2

22±1,2

21±2,3

Providencia alcalifaciens

12±0,7

22±1,2

21±2,2

28±1,9

19±0,7

20±0,7

Hafnia alvei

10±0,5

23±2,3

23±1,5

30±1,6

23±1,4

22±1,8

Morganella morganii

11±0,6

21±1,8

20±0,7

34±2,3

26±1,7

28±2,2

Enterobacter cloacae

10±0,4

20±2,4

17±0,4

33±2,6

22±1,2

24±1,6

Citrobacter freundii

13±1,7

18±0,8

16±0,9

30±1,8

19±1,9

25±2,4

Serratia marcescens

12±0,8

16±0,5

19±1,2

38±3,2

26±1,3

30±3,4

Erwinia amylovora

10±0,5

21±0,9

21±1,8

37±2,8

27±1,4

31±2,6

Kluyvera cryocrescens

8±0,3

20±1,3

23±2,5

31±2,6

22±2,3

26±1,8

Yersinia enterocolitica

10±0,7

15±0,6

20±1,7

27±1,8

20±1,8

22±1,5

 

Таблица 4

Антибиотикочувствительность энтеробактерий

Чистая культура

энтеробактерий

Антибиотики (значение зоны ингибиции роста (мм))

тетрациклин

доксициклин

полимиксин В

хлорамфеникол

Escherichia coli

17±0,3

16±0,8

18±1,5

18±0,7

Shigella dysenteriae

19±1,2

18±0,5

10±0,3

25±2,3

Shigella flexneri

20±1,6

15±0,4

12±0,8

20±2,6

Salmonella Enteritidis

18±0,9

14±0,7

10±0,6

22±1,8

Klebsiella oxytoca

24±1,8

13±0,9

19±1,3

31±2,5

Proteus vulgaris

27±2,2

16±0,5

8±0,5

26±2,5

Providencia alcalifaciens

22±1,4

20±1,2

10±1,8

20±2,3

Hafnia alvei

20±0,8

18±0,7

12±1,2

23±1,4

Morganella morganii

18±1,5

24±1,6

8±0,3

22±2,4

Enterobacter cloacae

19±0,7

26±2,4

10±1,6

21±1,3

Citrobacter freundii

25±2,3

28±2,7

18±1,4

19±1,5

Serratia marcescens

28±1,6

16±1,3

12±1,2

23±1,6

Erwinia amylovora

22±1,5

22±2,6

13±0,8

26±3,6

Kluyvera cryocrescens

20±1,3

18±0,5

14±0,9

25±1,8

Yersinia enterocolitica

10±0,5

34±2,3

13±1,5

27±2,7

 

Наибольшую антимикробную активность в отношении энтеробактерий проявляли цефепим, тетрациклин, доксициклин и хлорамфеникол. Наибольшая устойчивость энтеробактерии выявлена к цефалотину и к полимиксину В. Результаты определения антибиотикочувствительности энтеробактерий к хинолонам (налидиксовая кислота (невиграмон) № 1, офлоксацин (таривид) № 2 и ципрофлоксацин № 3) представлены в таблице 5. Чувствительность энтеробактерий к метронидазолу
№ 1,  фурадонину № 2, ко-тримоксазолу № 3 и триметоприму № 4 приведена в таблице 6.

Наибольшую антимикробную активность в отношении энтеробактерий проявляла налидиксовая кислота и триметоприм. Относительно хорошая устойчивость у большинства энтеробактерии выявлена к офлоксацину (таривид) и метронидазолу. 

В ходе выбора селективных компонентов рассматривали антибактериальные препараты, эффективные в отношении сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Были выбраны из группы гликопептидов ванкомицин, из группы оксазолидинонов линезолид, а из группы кетолидов телитромицин.

Таблица 5

Антибиотикочувствительность энтеробактерий к хинолонам

Чистая культура

энтеробактерий

Хинолоны (значение зоны ингибиции роста (мм))

№ 1

№ 2

№ 3

Escherichia coli

28±2,2

15±1,6

26±1,8

Shigella dysenteriae

20±1,3

16±0,8

23±1,5

Shigella flexneri

24±1,8

20±1,5

23±2,5

Salmonella Enteritidis

27±1,5

22±1,8

19±1,2

Klebsiella oxytoca

33±2,4

18±0,7

25±1,6

Proteus vulgaris

22±2,8

15±0,5

20±1,5

Providencia alcalifaciens

20±1,2

20±2,4

24±0,8

Hafnia alvei

28±3,4

24±3,2

20±0,6

Morganella morganii

20±3,8

17±0,5

29±1,4

Enterobacter cloacae

26±2,6

23±2,5

19±0,5

Citrobacter freundii

21±1,2

28±2,7

18±0,7

Serratia marcescens

24±1,7

16±2,2

22±1,8

Erwinia amylovora

33±3,6

19±1,6

20±1,3

Kluyvera cryocrescens

23±1,5

26±1,8

21±0,5

Yersinia enterocolitica

37±2,8

20±1,2

45±3,6

 

Таблица 6

Антибиотикочувствительность энтеробактерий

Чистая культура

энтеробактерий

Антибиотики (значение зоны ингибиции роста (мм))

№ 1

№ 2

№ 3

№ 4

Escherichia coli

8±0,8

18±1,2

17±0,5

26±2,3

Shigella dysenteriae

6±0,5

22±1,9

20±1,2

28±2,8

Shigella flexneri

5±0,4

26±2,2

25±1,5

30±2,6

Salmonella Enteritidis

8±1,4

15±0,8

20±1,6

22±1,8

Klebsiella oxytoca

10±1,6

8±1,8

25±3,2

24±1,5

Proteus vulgaris

12±1,8

12±1,3

25±3,8

28±2,5

Providencia alcalifaciens

8±0,8

20±1,4

25±2,6

25±1,8

Hafnia alvei

10±1,2

18±2,2

23±2,5

23±2,0

Morganella morganii

12±1,5

10±3,5

27±4,5

26±1,7

Enterobacter cloacae

10±1,4

8±1,4

26±1,9

27±2,2

Citrobacter freundii

8±0,5

20±1,6

25±1,5

30±2,4

Serratia marcescens

8±1,2

19±0,6

22±0,7

35±3,4

Erwinia amylovora

10±2,2

12±1,3

37±6,2

34±2,6

Kluyvera cryocrescens

12±2,6

18±1,2

21±0,9

32±3,6

Yersinia enterocolitica

10±1,5

28±0,6

21±0,7

30±2,7

 

Ванкомицин является антибиотиком, ингибирующим биосинтез клеточной стенки бактерий, блокируя синтез пептидогликана. Ванкомицин проявляет активность в отношении большинства грамположительных микроорганизмов, особенно в отношении Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Enterococcus spp., в том числе проявляющих устойчивость к антибактериальным препаратам других групп. Устойчивой резистентности к ванкомицину у грамположительных микроорганизмов не выявлено, за исключением единичных клинических случаев. Ванкомицин не имеет перекрёстной резистентности с другими антибиотиками.

Линезолид ингибирует биосинтез микробного белка по принципиально новому механизму действия, чем существенно превосходит по эффективности макролиды, линкозамиды, хлорамфеникол, тетрациклины и аминогликозиды. Линезолид высоко активен в отношении полирезистентных Staphylococcus spp. и Enterococcus spp., а также в отношении Streptococcus pneumonia, Bacillus spp., Corynebacterium spp., Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis и Rhodococcus spp., Clostridium perfringens, C. difficile, Peptostreptococcus spp., Bacteroides fragilis. К линезолиду проявляют чувствительность и грамотрицательные бактерии Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, Legionella spp., Bordetella pertussis и B. parapertussis. Линезолид обладает достаточно высокой активностью в отношении чувствительных и устойчивых грамположительных бактерий к оксациллину, аминогликозидам, фторхинолонам, макролидам и гликопептидам.

Телитромицин ингибирует биосинтез микробного белка у грамположительных бактерий (прежде всего у Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.), проявляет активность в отношении некоторых грамотрицательных бактерий (Neisseria spp., Haemophilus spp., Legionella spp., Helicobacter spp.), а также высокоактивен в отношении Chlamydia spp., Mycoplasma spp. Телитромицин (кетолид) сохраняет активность в отношении всех штаммов бактерий, устойчивых к макролидам и линкосамидам.

В результате минимальная подавляющая концентрация (МПК) ванкомицина и телитромицина для большинства культур энтеробактерий составляла 0,063 г/дм3, а МПК линезолида была на уровне 0,031 г/дм3. Обильный рост культур энтеробактерий наблюдался при концентрации ванкомицина и телитромицина 0,008 г на дм3 среды, а линезолида в концентрации 0,004 на дм3 среды.
В итоге разработанная селективная добавка к питательной среде
Drigalski Lactose Agar включает ванкомицин, линезолид и телитромицин (табл. 7). В связи с этим было решено присвоить данной добавке следующее наименование «Селективная добавка ВЛТ». 

Таблица 7

Состав селективной добавки ВЛТ

Препараты антибактериальные

Концентрация, г/дм3

Ванкомицин

0,008

Линезолид

0,004

Телитромицин

0,008

 

Заключение. Наибольшую антимикробную активность в отношении всех выделенных культур энтеробактерий проявляли карбенициллин 30±2,3 из группы карбоксипенициллинов и пиперациллин 37±2,5 из группы уреидопенициллинов, канамицин 24±1,5, амикацин 26±1,7 и гентамицин 25±0,8, цефепим 38±3,2 из группы цефалоспоринов IV поколения, тетрациклин 28±1,6, доксициклин 34±2,3 и хлорамфеникол 31±2,5, налидиксовая кислота 37±2,8, триметоприм 35±3,4. Высокую устойчивость энтеробактерии проявляли к бензилпенициллину из группы естественных пенициллинов, к стрептомицину, цефалотину из группы цефалоспоринов I поколения, к полимиксину В, к офлоксацину (таривид) и метронидазолу. В ходе выбора селективных компонентов рассматривали антибактериальные препараты, эффективные в отношении сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Были выбраны из группы гликопептидов ванкомицин, из группы оксазолидинонов линезолид,  из группы кетолидов телитромицин. В состав разработанной селективной добавки к среде Drigalski Lactose Agar введены антибиотики ванкомицин и телитромицин в дозе 0,008 г/дм3, линезолид в дозе 0,004 г/дм3 среды.

Список литературы

1. Ермаков, В. В. Модификация дифференциально-диагностической среды для выявления и дифферен-циации энтеробактерий / В. В. Ермаков, О. О. Датченко // Сборник научных трудов Краснодарского научного центра зоотехнии и ветеринарии. - 2018. - Т. 7, № 1. - С. 174-179.

2. Поздеев, О. К. Детекция бета-лактамаз амрсуклинических изолятов энтеробактерий / О. К. Поздеев, Н. Ю. Куряева, А. З. Валиуллина [и др.] // Практическая медицина. - 2018. - № 1 (112).- С. 148-152.

3. Парамонова, Н. Ю. Мониторинг распространения антимикробной резистентности в Костромской обла-сти / Н. Ю. Парамонова, В. В. Кузьмичёв, М. Ю. Якубовская // Инновации в АПК: проблемы и перспективы. - 2017. - № 4 (16).- С. 160-163.

4. Стребкова, В. В. Динамика распространения карбапенемаз грамотрицательных бактерий в отделениях Воронежской городской клинической больницы скорой медицинской помощи № 10 / В. В. Стребкова, О.Н. Затолокина, М.С. Старкова, М.И. Калинина // Многопрофильный стационар. - 2017. - Т.4, №1. - С. 19-21.

5. Тапальский, Д. В. Металло-бета-лактамазы и карбапенемазы экстремально-антибиотикорезистентных энтеробактерий: распространение в Беларуси / Д. В. Тапальский, В. А. Осипова, Е. О. Евсеенко // Здраво-охранение (Минск). - 2017. - № 3. - С. 40-47.

6. Шепелин, А. П. Современное состояние и тенденции в разработке, производстве и применении пита-тельных сред // Бактериология. - 2016. - Т. 1, № 1. - С. 42-47.

7. Шелепин, А. П. Современное состояние и направления развития производства питательных сред в России // Современная лабораторная диагностика. - 2015. - № 2 (16). - С. 18-20.

8. Шилова, А. Н. Характеристика энтеробактерий с множественной резистентностью, колонизирующих кишечный тракт у детей раннего возраста с врождёнными пороками сердца при поступлении в кардиохи-рургический стационар / А. Н. Шилова, В. Н. Ильина, А. И. Субботовская // Клиническая микробиология и ан-тимикробная химиотерапия. - 2016. - Т. 18, № 1. - С. 68-74.

9. Эленшлегер, А. А. Влияние препарата «Ветом 2» на микробный пейзаж кишечника у телят после анти-биотикотерапии / А. А. Эленшлегер, В. А. Афанасьеф // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2017. - № 2 (148). - С. 126-132.

10. Пат. 163081 Российская Федерация, МПК С12М 1/14, А61В 10/02. Одноразовый стерильный микро-биологиче-ский г-образный шпатель / Ермаков В. В. - №2016100537/14 ; заявл.11.01.2016 ; опубл. 10.07.2016 ; Бюл. № 19.

Войти или Создать
* Забыли пароль?