Россия
УДК 631.46 Бактериология и биология почв
Исследования проводили с целью определения роли штаммов почвенных бактерий Pantoea brenneri в повышении биодоступности почвенного фосфора и оценки биотехнологического потенциала штаммов для использования в качестве биоудобрений. Почвенные микрокосмы создавали в четырех вариантах: инокулированная нестерильная почва (30 г + 5 мл суспензии P. brenneri, 1,5×108 КОЕ/мл); контроль с нестерильной почвой (30 г + 5 мл 0,9 % NaCl); инокулированная стерильная почва (30 г + 5 мл суспензии P. brenneri, 1,5×108 КОЕ/мл); контроль со стерильной почвой (30 г + 5 мл 0,9 % NaCl). Микрокосмы инкубировали в течение 15 суток, образцы отбирали в начале и конце инкубации. Фосфатмобилизацию штаммов P. brenneri в почве подтверждает повышение уровня экспрессии генов gdh (глюкозодегидрогеназа) и pho (фосфатаза), продукты которых участвуют в солюбилизации и минерализации труднодоступных соединений фосфора. Экспрессия целевых генов в стерильной почве была выше, чем в нестерильной, в зависимости от времени инкубации и используемого штамма: в отношении гена gdh – в среднем в 1,2…1,9 раз, гена pho – в среднем в 1,3…1,7 раз. Внесение суспензии штаммов в почву способствовало увеличению числа биодоступных форм фосфора в стерильной почве в среднем на 22…27 %, в нестерильной – на 15…18 %. Штаммы P. brenneri сохраняли выживаемость в почве на протяжении всего эксперимента, что характеризует их способность к конкуренции с нативной почвенной микрофлорой. На 5 сутки инкубации отмечали 6…8-кратное увеличение числа КОЕ/г почвы, по сравнению с начальной точкой (0 сутки), а на 15 сутки величина этого показателя превышала исходную величину в среднем в 3…4 раза.
фосфатмобилизация, минерализа ция, солюбилизация, биопрепараты, Pantoea brenneri
Введение. Фосфор (P) – один из основных макроэлементов, необходимых для нормального функционирования растений на всех этапах роста и развития. Однако низкая биодоступность фосфора в почвах считают значительным препятствием для роста и продуктивности сельскохозяйственных культур во многих регионах мира [1].
Общепринятое решение этой проблемы – внесение минеральных фосфорных удобрений – характеризуется низкой эффективностью, поскольку лишь незначительная часть (не более 25 %) внесенного фосфора усваивается растениями, в то время как остальная часть переходит в недоступные формы [2]. Ситуацию усугубляет негативное воздействие избыточного применения фосфорных удобрений на окружающую среду. В связи с этим возрастает интерес к разработке и применению экологически безопасных и эффективных стратегий улучшения фосфорного питания растений. Одним из перспективных направлений считают использование потенциала почвенных микроорганизмов, способных мобилизовать недоступные формы фосфора. Фосфатмобилизующие микроорганизмы преобразуют неорганические (Pi) и органические (Po) соединения фосфора в доступные для растений формы посредством механизмов солюбилизации и минерализации [3]. К ним отнесены представители различных родов, таких как Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, Pantoea, Rhizobium, Acinetobacter, Arthrobacter и др. Использование фосфатмобилизующих микроорганизмов в качестве биоудобрений представляет собой экологически обоснованную альтернативу минеральным фосфорным удобрениям [4]. Помимо участия в круговороте фосфора фосфатмобилизующие микроорганизмы способны синтезировать фитогормоны, сидерофоры, антибактериальные и противогрибковые метаболиты, индуцировать системную резистентность растений, способствуя их благоприятному росту и обеспечивая устойчивость к различным абиотическим и биотическим стрессам [1].
Одна из широкоизученных групп фосфатмобилизующих бактерий – представители рода Pantoea из семейства Enterobacteriaceae, обладающих множеством биодеградационных свойств и характеризующихся широкой экологической адаптивностью [5, 6, 7]. В проведенных нами ранее исследованиях, объектами которых были почвенные изоляты Pantoea brenneri, показаны множественные положительные эффекты бактерий на рост и жизнедеятельность растений. Так, установлена способность к выделению ионов аммония и цианидов, секреции комплекса гидролитических ферментов, фиксации азота, синтезу фитогормонов и сидерофоров, определена ингибирующая активность в отношении широкого спектра фитопатогенных микроорганизмов [8, 9]. Для штаммов P. brenneri показана способность к разложению органических и неорганических труднорастворимых фосфоросодержащих соединений в условиях in vitro, а в их геноме идентифицированы гены, продукты которых вовлечены в метаболизм фосфора, включая 3-фитазу, глюкозо-1-фосфатазу, щелочную фосфатазу, глюкозодегидрогеназу и др. [10].
Несмотря на активное изучение фосфатмобилизующих микроорганизмов как основы для создания биоудобрений, одним из основных препятствий для их широкого применения в агропроизводстве остаётся несоответствие результатов, полученных в лабораторных условиях, с эффективностью в полевых испытаниях. Большинство исследований проводится in vitro на искусственных питательных средах, что не всегда отражает метаболизм и физиологическую активность бактерий в естественной почвенной среде [11]. Таким образом, исследования, направленные на изучение функционирования фосфатмобилизующих микроорганизмов в условиях, максимально приближенных к естественным, приобретают особую значимость.
Цель исследования – определение роли штаммов почвенных бактерий P. brenneri в повышении биодоступности почвенного фосфора и оценка биотехнологического потенциала штаммов для использования в качестве биоудобрений.
Условия, материалы и методы. Объектом исследований были бактериальные штаммы P. brenneri (3.2 и 3.5.2), выделенные ранее из образцов почв республики Татарстан [12, 13].
Эксперименты проводили в условиях почвенных микрокосмов. Образцы почвы отбирали в конце сентября 2023 г. с глубины 15 см на сельскохозяйственном поле культуры картофеля личного подсобного хозяйства (г. Казань, Республика Татарстан, 55.740608 широты и 49.269000 долготы). Отобранные образцы помещали в стерильные ёмкости и транспортировали в лабораторию. Для подготовки к эксперименту почву высушивали при температуре +20°C, просеивали через сито с диаметром ячеек 2 мм и выдерживали при +4°C в течение одной недели, после чего помещали в горшки по 30 г. Почвенные микрокосмы создавали в четырех вариантах с трехкратной повторностью: 1) инокулированная почва (живая) – к 30 г нестерильной почвы добавляли 5 мл суспензии бактериальных клеток P. brenneri (1,5×108 КОЕ/мл) в стерильном физиологическом растворе (0,9 % NaCl); 2) контроль (живая почва) – к 30 г нестерильной почвы добавляли 5 мл стерильного физиологического раствора (0,9 % NaCl); 3) инокулированная почва (стерильная) – к 30 г стерильной почвы добавляли 5 мл суспензии бактериальных клеток P. brenneri (1,5×108 КОЕ/мл) в стерильном физиологическом растворе (0,9 % NaCl); 4) контроль (стерильная почва) – к 30 г стерильной почвы добавляли 5 мл стерильного физиологического раствора (0,9 % NaCl). Стерилизацию почвы проводили путем автоклавирования при 121 °C и 1 атм. в течение 30 минут, повторяя цикл пять раз. Подготовленные микрокосмы инкубировали в течение 15 суток при температуре +28…30°С с 16-часовым световым периодом и интенсивностью освещения 2000 люкс/м2. Образцы почвы отбирали в начале (T0) и в конце (T15) инкубации с помощью стерильных инструментов. Полученные образцы хранили при -20 °С до проведения анализа.
Для анализа экспрессии генов, продукты которых участвуют в метаболизме фосфора, из образцов почвы выделяли суммарную РНК с помощью набора RNeasy PowerSoil Total RNA Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Экспрессию генов, кодирующих фосфатазы (pho) и глюкозодегидрогеназу (gdh), оценивали методом количественной ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) с помощью набора OneTub RT-PCR SYBR (Евроген, Россия) и амплификатора Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Для амплификации использовали следующие праймеры: pho: 5’-ATGCGCGACCGAAAGACC-3’ (прямой) и 5’-TGCTGGCGACGAGACGAA-3’ (обратный); gdh: 5’-CAGGTACTGAAACCGGCATT-3’ (прямой) и 5’-TACGCTGTTTCCACACCAC-3’ (обратный). Программа проведения количественной ОТ-ПЦР включала следующие этапы: обратная транскрипция (55 °C – 15 мин), инактивация ревертазы и активация полимеразы (95 °C – 1 мин), 50 циклов (денатурация: 95 °C – 15 сек, отжиг праймеров: 67,5 °C – 20 сек, элонгация и измерение флуоресценции: 72 °C – 20 сек), кривая плавления (55…95 °C с шагом 0,5 °C). Нормализацию уровней экспрессии целевых генов проводили по отношению к уровню экспрессии референтного гена leuS (ген лейцин-тРНК-лигазы). Для амплификации leuS использовали следующие праймеры: 5’-CCGGTCGATCAGTATGTGGG-3’ (прямой) и 5’-TTGGAGTTAACCAGACCGGC-3’ (обратный). Результаты OT-ПЦР анализировали методом 2-ΔΔCt на основе значений порога цикла (Ct). Сначала рассчитывали ΔCt путем вычитания среднего значения Ct референтного гена из среднего значения Ct целевого гена, а затем рассчитывали значение ΔΔCt вычитанием значений ΔCt контроля (без внесения в почву штаммов) из опыта (с внесением штаммов). Все образцы анализировали в трех повторностях, включая отрицательные контроли без матрицы и ревертазы.
В образцах почвы, отобранных из микрокосмов, определяли количество подвижных форм фосфора. Экстракцию фосфора проводили по методу Олсена [14], применимому для анализа как кислых, так и карбонатных почв. Для этого 1 г почвы инкубировали в 20 мл 0,5 М раствора гидрокарбоната натрия (pH 8,5) при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученную суспензию обесцвечивали добавлением 0,5 г активированного угля и фильтровали через плотный фильтр. Фильтрат нейтрализовали 10 %-ным раствором соляной кислоты. Количество свободных фосфатов в полученных образцах определяли колориметрически по методу Грейнера [15], основанному на способности неорганических фосфатов в кислой среде образовывать с молибдатом аммония соединение желтого цвета – фосфорномолибденовокислый аммоний. Для проведения анализа в пробирки вносили 100 мкл фильтрата и добавляли 750 мкл свежеприготовленного реагента, состоящего из 10 мМ раствора гептамолибдата аммония, 5 М раствора серной кислоты и ацетона в соотношении 1:1:2. Затем в пробирки добавляли 50 мкл 1 М раствора лимонной кислоты. Оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 355 нм. Для определения содержания свободных фосфатов строили градуировочный график на основе 9 мМ раствора дигидрофосфата калия различных концентраций. Уровень pH в образцах почвы, отобранных из микрокосмов, определяли следующим образом: к навеске почвы в стеклянной колбе добавляли воду в соотношении 1:2,5 и перемешивали в течение 10 минут. Измерение pH в полученной суспензии проводили с помощью pH-метра (Mettler Toledo, Швейцария).
Оценивали жизнеспособность штаммов P. brenneri в микрокосмах в динамике методом почвенных разведений. Для этого из микрокосмов на 0, 5, 10 и 15 сутки инкубации отбирали 1 г почвы, которую разводили в 99 мл стерильной водопроводной воды. Полученную почвенную суспензию разводили серийно и высевали поверхностным методом на плотную питательную среду Лурия-Бертани (LB) (триптон – 10 г/л, хлорид натрия – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, агар микробиологический – 15 г/л). Чашки Петри с посевами инкубировали при +30 °С в течение 24 ч. Для визуализации колоний использовали штаммы P. brenneri, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем плазмиды pFPV25.1_mut3. Среднее количество КОЕ (N) в 1 г почвенной суспензии рассчитывали по формуле:
N = c / ((n1 + 0,1 × n2) × d),
где c – сумма подсчитанных колоний на всех чашках, n1 – количество чашек первого разведения, n2 – количество чашек второго разведения, d – коэффициент первого разведения, 0,1 – коэффициент, учитывающий кратность первого и второго разведения.
Эксперименты проводили в трех биологических и трех аналитических повторах. Достоверную разницу между группами анализировали с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) и критерия Тьюки. Уровень значимости составлял p<0,05.
Результаты и обсуждение. На первом этапе исследований оценивали экспрессию вовлеченных в метаболизм фосфора генов gdh (глюкозодегидрогеназа) и pho (фосфатаза) у штаммов P. brenneri (3.2 и 3.5.2) в почвенных микрокосмах в динамике. Внесение суспензии исследуемых бактерий как в нестерильную, так и в стерильную почву приводило к увеличению экспрессии целевых генов. При этом к 15-м суткам инкубации наблюдали снижение уровня экспрессии, по сравнению с началом эксперимента, как гена gdh (в среднем в 1,3…2,1 раза), так и гена pho (в среднем в 1,3…1,6 раза), в зависимости от варианта почвы и используемого штамма (рис. 1). Такое снижение может быть обусловлено уменьшением количества внесенных бактериальных клеток или снижением их метаболической активности в ходе эксперимента, что согласуется с данными, представленными в ряде публикаций [11, 16]. При этом на протяжении всего эксперимента экспрессия целевых генов в вариантах со стерильной почвой была выше, чем в вариантах с нестерильной почвой: в отношении гена gdh – в среднем в 1,2…1,9 раз, в отношении гена pho – в среднем в 1,3…1,7 раз в зависимости от времени инкубации и используемого штамма. Вероятно, в нестерильной почве процессы адаптации внесенных штаммов P. brenneri к новым условиям и конкуренция с нативной почвенной микрофлорой влияли на физиологические процессы в клетках, в том числе на мобилизацию фосфатов. Таким образом, результаты, полученные в ходе эксперимента со стерильной почвой, подтверждают, что наблюдаемое увеличение экспрессии генов gdh и pho напрямую связано с присутствием и активностью изучаемых штаммов P. brenneri в почве.
Рис. 1 – Изменение уровня экспресии генов фосфатазы (pho) и глюкозодегидрогеназы (gdh) в нестерильной и стерильной почве, инокулированной штаммами P. brenneri 3.2 и P. brenneri 3.5.2, на начало (0 сут, T0) и конец (15 сут, Т15) эксперимента (*различия внутри групп, обозначенных квадратной скобкой (экспрессия отдельных генов на 0 сут и 15 сут), достоверные при p <0,05).
Результаты измерения числа свободных фосфатов в образцах почвы показало, что на начальном этапе эксперимента существенных различий между вариантами с инокуляцией штаммами P. brenneri и контрольными образцами не наблюдали. Однако к концу эксперимента в вариантах с внесением штаммов P. brenneri наблюдали увеличение количества подвижного фосфора. Так, в стерильной почве концентрация биодоступного фосфора увеличилась на 27±1,4 % (штамм 3.2) и 22±1,2 % (штамм 3.5.2) по сравнению с контролем (без внесения штаммов). В нестерильной почве увеличение составило 15±0,8 % (штамм 3.2) и 18±0,7 % (штамм 3.5.2) по сравнению с контролем (рис. 2).
Рис. 2 – Изменение числа свободных фосфатов в нестерильной и стерильной почве, инокулированной штаммами P. brenneri 3.2 и P. brenneri 3.5.2, на начало (0 сут, T0) и конец (15 сут, Т15) эксперимента. За 100 % принимали число свободных фосфатов в контрольном (без внесения штаммов) варианте почвы на начало эксперимента (*различия с контролем достоверные при p <0,05).
Все исследуемые штаммы P. brenneri обладали способностью подкислять почвенный раствор – уровень pH снижался со значений 6,6…6,7 ед. до pH 5,2…5,3 ед. Однако ранее в лабораторных условиях установлено, что изучаемые штаммы подкисляли среду культивирования с pH 7,0 до уровня pH 2,0…3,0, продуцируя при этом широкий спектр органических кислот [10]. Вероятно, снижение pH почвенного раствора представляет лишь один из механизмов процесса фосфатмобилизации у штаммов P. brenneri наряду с секрецией ферментов, в частности фосфатаз и фитаз.
Сохранение жизнеспособности микробных клеток – один из ключевых факторов в технологии разработки биопрепаратов. Штаммы P. brenneri сохраняли свою жизнеспособность в почвенных образцах в течение всего эксперимента. При этом, на 5 сутки отмечали 6…8-кратное увеличение числа КОЕ/г почвы, по сравнению с начальной точкой (0 сутки), тогда как на 15 сутки число КОЕ/г почвы превышало исходную величину этого показателя в среднем в 3…4 раза (см. табл.). Способность бактериальных штаммов выживать в почве во многом зависит от их возможности конкурировать с адаптированной к условиям нативной микрофлорой почвы. Одной из стратегий для преодоления этих ограничений считают использование автохтонных микроорганизмов, адаптированных к климатическим условиям каждого региона [17, 18]. Поэтому, использование штаммов P. brenneri, ранее выделенных из почвы республики Татарстан, открывает перспективу их использования в регионе.
Таблица – Оценка жизнеспособности штаммов P. brenneri 3.2 и P. brenneri 3.5.2 в почве, КОЕ/г почвы
|
Штаммы |
Время, сут |
|||
|
0 |
5 |
10 |
15 |
|
|
P. brenneri 3.2 |
2,02×106 |
1,22×107 |
9,1×106 |
7,1×106 |
|
P. brenneri 3.5.2 |
1,7×106 |
1,36×107 |
9,3×106 |
6,8×106 |
Выводы. Повышение штаммами почвенных бактерий P. brenneri биодоступности почвенного фосфора указывает на их биотехнологический потенциал для использования в качестве биоудобрений.
Внесение суспензии штаммов бактерий P. brenneri (3.2 и 3.5.2) в почву стимулировало экспрессию генов gdh и pho, участвующих в метаболизме фосфора. В зависимости от варианта почвы и штамма уровень экспрессии gdh к 15-м суткам инкубации снижался в среднем в 1,3…2,1 раза, pho – в 1,3…1,6 раза. В стерильной почве она была выше, чем в нестерильной, в среднем в 1,2…1,9 и 1,3…1,7 раза соответственно.
Внесение в почву суспензии штаммов P. brenneri увеличивало концентрацию биодоступного фосфора в почвенном растворе к 15-м суткам эксперимента. В стерильной почве в варианте со штаммом 3.2 она возрастала, по сравнению с контролем, на 27±1,4 %, со штаммом 3.5.2 – 22±1,2 %, в нестерильной – соответственно на 15±0,8 % и 18±0,7 %.
Одновременно штаммы P. brenneri подкисляли почвенный раствор, снижая pH с 6,6…6,7 ед. до 5,2…5,3 ед. и сохраняли жизнеспособность в почвенных образцах на протяжении всего эксперимента.
В связи с изложенным, изученные штаммы P. brenneri модно считать перспективными для создания биопрепаратов, повышающих содержание биодоступного фосфора в почве.
1. Phosphate-solubilizing microorganisms: mechanism and their role in phosphate solubilization and uptake / P. Rawat, S. Das, D. Shankhdhar, et al. // Journal of Soil Science and Plant Nutrition. 2020. Vol. 21. P. 49–68. doi:https://doi.org/10.1007/s42729-020-00342-7.
2. Timofeeva A., Galyamova M., Sedykh S. Prospects for using phosphate-solubilizing microorganisms as natural fertilizers in agriculture // Plants. 2022. Vol. 11. No. 16. Article 2119. URL: https://www.mdpi.com/2223-7747/11/16/2119 (дата обращения: 4.05.2025). doi:https://doi.org/10.3390/plants11162119.
3. Roles of phosphate solubilizing microorganisms from managing soil phosphorus deficiency to mediating biogeochemical P cycle / J. Tian, F. Ge, D. Zhang, et al. // Biology. 2021. Vol. 10. No. 2. Article 158. URL: https://www.mdpi.com/2079-7737/10/2/158 (дата обращения: 4.05.2025). doi:https://doi.org/10.3390/biology10020158.
4. Phosphate solubilizing microbes: Sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils / S. B. Sharma, R. Sayyed, M. H. Trivedi, et al. // SpringerPlus. 2013. Vol. 2. No. 1. Article 587. URL: https://link.springer.com/article/10.1186/2193-1801-2-587 (дата обращения: 4.05.2025). doi:https://doi.org/10.1186/2193-1801-2-587.
5. Bhatia S., Sharma D. Biodesulfurization of dibenzothiophene, its alkylated derivatives and crude oil by a newly isolated strain Pantoea agglomerans D23W3 // Biochem. Eng. J. 2010. Vol. 50. No. 3. P. 104–109. doi:https://doi.org/10.1016/j.bej.2010.04.001.
6. Walterson A. M., Stavrinides J. Pantoea: insights into a highly versatile and diverse genus within the Enterobacteriaceae // FEMS Microbiol. Rev. 2015. Vol. 39. No. 6. P. 968–984. doi:https://doi.org/10.1093/femsre/fuv027.
7. Chen Q., Liu S. Identification and characterization of the phosphate-solubilizing bacterium Pantoea sp. S32 in reclamation soil in Shanxi, China // Frontiers in Microbiology. 2019. Vol. 10. Article 2171. URL: https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2019.02171/full (дата обращения: 4.05.2025). doi:https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02171.
8. Иткина Д. Л., Сулейманова А. Д., Шарипова М. Р. Pantoea brenneri AS3 и Bacillus ginsengihumi M2.11 как потенциальные агенты биоконтроля и стимуляторы роста растений // Микробиология. 2021. Т. 90. № 2. С. 204–214. doi:https://doi.org/10.31857/S0026365621020063.
9. Антагонистические штаммы Pantoea brenneri как средства защиты растений / Д. С. Бульмакова, Г. И. Шагиева, Д. Л. Иткина и др. // Микология и фитопатология. 2023. Т. 57. № 5. С. 352–361. doi:https://doi.org/10.31857/S0026364823050033.
10. Phosphate solubilization and plant growth promotion by Pantoea brenneri soil isolates / A. Suleimanova, D. Bulmakova, L. Sokolnikova, et al. // Microorganisms. 2023. Vol. 11. No. 5. Article 1136. URL: https://www.mdpi.com/2076-2607/11/5/1136 (дата обращения: 4.05.2025). doi:https://doi.org/10.3390/microorganisms11051136.
11. The impact of the inoculation of phosphate-solubilizing bacteria Pantoea agglomerans on phosphorus availability and bacterial community dynamics of a semi-arid soil / I. Saadouli, A. Mosbah, R. Ferjani, et al. // Microorganisms. 2021.Vol. 9. No. 8. Article 1661. URL: https://www.mdpi.com/2076-2607/9/8/1661 (дата обращения: 4.05.2025). doi:https://doi.org/10.3390/microorganisms9081661.
12. Novel glucose-1-phosphatase with high phytase activity and unusual metal ion activation from soil bacterium Pantoea sp. strain 3.5.1 / A. D. Suleimanova, A. Beinhauer, L. R. Valeeva, et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2015. Vol. 81. No. 19. P. 6790–6799. doi:https://doi.org/10.1128/AEM.01384-15.
13. Идентификация фитат-гидролизующих ризобактерий рода Pantoea на основе фенотипических признаков и мультилокусного анализа / А. Д. Сулейманова, Д. Л. Иткина, Д. С. Пудова и др. // Микробиология. 2021. Т. 90. № 1. С. 87–95. doi:https://doi.org/10.1134/S0026261721010112.
14. Olsen S. R. Estimation of available phosphorus in soils by extraction with sodium bicarbonate. Washington, D.C.: U.S. Dept. of Agriculture, 1954. 19 p.
15. Greiner R., Konietzny U., Jany K. D. Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli // Arch. Biochem. Biophys. 1993. Vol. 303. No. 1. P. 107–113. doi:https://doi.org/10.1006/abbi.1993.1261.
16. Strigul N. S., Kravchenko L. V. Mathematical modeling of PGPR inoculation into the rhizosphere // Environ. Model. Softw. 2006. Vol. 21. No. 8. P. 1158–1171. doi:https://doi.org/10.1016/j.envsoft.2005.06.003.
17. Formulation of a highly effective inoculant for common bean based on an autochthonous elite strain of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli, and genomic-based insights into its agronomic performance / R. Pastor-Bueis, C. Sanchez-Cañizares, E. K. James, et al. // Frontiers in Microbiology. 2019. Vol. 10. Article 2724. URL: https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2019.02724/full (дата обращения: 4.05.2025). doi:https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02724.
18. Tina W., Walde-Meskel E., Wallet F. Symbiotic efficiency of native and exotic rhizobium strains nodulating lentil (Lens culinaris Medik.) in soils of southern Ethiopia // Agronomy. 2016. Vol. 6. No. 1. Article 11. URL: https://www.mdpi.com/2073-4395/6/1/11 (дата обращения: 4.05.2025). doi:https://doi.org/10.3390/agronomy6010011.
