Улан-Удэ, Республика Бурятия, Россия
Улан-Удэ, Республика Бурятия, Россия
Улан-Удэ, Республика Бурятия, Россия
В статье представлены результаты исследований пробиотических свойств симбиотической закваски на основе кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий. Установлено, что при введении пропионовокислых бактерий в консорциум микроорганизмов кефирной грибковой закваски повышается не только антимутагенная, но и антагонистическая и витаминобразующая активность комбинированной закваски.
Пропионовокислые бактерии, кефирная грибковая закваска, антимутагенная активность, антибиотики, витамины, пробиотические свойства.
Введение
В последние годы концепция оздоровления человека и предупреждения старения организма путем включения в рацион кисломолочных продуктов развивается в направлении определения звеньев механизма, которые в целом характеризуются как пробиотическое воздействие [1, 2].
Взаимосвязь макроорганизма и его микрофлоры очень велика. Нормальная микрофлора влияет на структуру слизистой оболочки кишечника и ее адсорбционную способность, участвует в обмене жирных кислот, метаболизме липидов, желчных кислот, билирубина, водно-солевом и газообмене. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта совершают ряд ферментативных реакций, синтезируют витамин К, витамины группы В, никотиновую, фолиевую и пантотеновую кислоты [3, 4].
Недостаток представителей здоровой микрофлоры вызывает ослабление как клеточных, так и гуморальных факторов иммунологической защиты. Нормальная микрофлора благодаря выраженной антагонистической активности предохраняет организм от внедрения патогенной флоры.
Дисбаланс микробной экологии человека приводит к тяжелым заболеваниям как желудочно-кишечного тракта, так и организма в целом. В связи с этим актуальной является разработка продуктов, обладающих пробиотическими свойствами.
В настоящее время достаточно фактических данных, свидетельствующих о наличии пробиотических свойств у пропионовокислых бактерий.
Пропионовокислые бактерии не перевариваются в желудочно-кишечном тракте людей, устойчивы к действию желчных кислот и выдерживают низкую (рН 2.0) кислотность желудка. Они ингибируют активность р-глюкуронидазы, азаредуктазы и нитроредуктазы – ферментов, образуемых кишечной микрофлорой и вовлекаемых в образование мутагенов, канцерогенов и промоторов роста опухолей [5].
Классические пропионовокислые бактерии образуют ряд белковых бактериоцинов. Штаммы Propionibacterium thoenii и Propionibacterium jensenii образуют термоустойчивые белки, ингибирующие ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжей и плесеней [6, 7].
Экспериментальные и клинические испытания пропионовых бактерий показали иммуномодули-рующую, антивирусную активность в клинических исследованиях, что связывают с активацией моноцитмакрофаговой системы, индукцией синтеза интерферона и активацией киллерных клеток [6, 8].
Пагубное действие на организмы радиационных излучений и химических мутагенов связано с возникновением свободных радикалов. Потенциальными биологическими мишенями для радикальной атаки служат липиды, белки, нуклеиновые кислоты. Свободные радикалы часто вовлекаются в активацию многих типов прокарциногенов и промутагенов, превращая их в карциногены и мутагены и связывая эти активированные формы с ДНК. Пропионовокислые бактерии служат источником ряда веществ, предотвращающих данные негативные реакции в организме [9].
В ряде исследований показана высокая антимутагенная активность пропионовокислых бактерий, которая коррелирует с накоплением в среде тиоловых соединений. Максимальная антимутагенная активность соответствует максимальной аккумуляции в среде тиолов. Антимутагенная защита пропионовых бактерий не только способствует сохранению собственного генотипа, но и может быть использована для стабилизации генотипов и микробных ферментаций других организмов.
Исследования последних лет показывают, что в пробах содержимого кишечника долгожителей наряду с дрожжевой микрофлорой определяется наличие и видовой состав молочнокислых бактерий. Оказалось, что повышение содержания в кишечнике долгожителей коррелирует с высоким количеством молочнокислых бактерий [10].
Антагонизм молочнокислых бактерий обусловлен способностью образовывать специфические антибиотические вещества: S. Lactis – низина, S. Cremoris – диплококкцина, L. Acidohilus – ацидофилина и лактоцидина, L. Plantarum – лактолина, L. Brevis – бревина и др.
Антибиотики, являясь специфическими продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, обладают высокой физиологической активностью по отношению к определенным патогенным группам, вирусам или злокачественным опухолям, задерживая их рост или полностью подавляя их развитие.
Установленная в последние годы способность молочнокислых бактерий стимулировать образование интерферона и выводить радионуклеиды позволяет говорить о необходимости получения высокопродуктивных штаммов, обладающих биосинтетическими свойствами, особенно физиологической активностью и антагонизмом, положительно влияющих на состояние здоровья человека и играющих важную роль в создании фермента долголетия [11].
При разработке продуктов нового поколения предлагается использовать микроорганизмы, способные оказывать положительное влияние на иммунную систему человека. В связи с этим большой интерес представляет применение таких эффективных иммуностимулирующих средств, как кефир.
Высокая питательная ценность кефира объясняется главным образом тем, что в нем белки молока находятся в более усвояемой форме, чем в натуральном молоке. Пептонизация белков молока в процессе сквашивания вызывается молочной кислотой, образующейся в кефире, и ферментами, выделяемыми молочнокислыми бактериями, и отчасти дрожжами. По мере протекания молочнокислого и спиртового брожения количество продуктов распада белков увеличивается [12]. Наличие молочнокислых бактерий и дрожжей с их способностью синтезировать антибиотики и витамины дополняет высоколечебное и диетическое значение кефира [11]. Особенно часто кефир применяется при хронических расстройствах пищеварительной деятельности под влиянием различных заболеваний желудочно-кишечного тракта: стимулирует выделение пищеварительных соков, нормализует моторную функцию пищеварительного тракта, возбуждает аппетит. Нередко люди, страдающие аллергией к молоку, хорошо переносят кефир [13].
Целью данной работы является создание консорциума микроорганизмов кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий и изучение пробиотических свойств полученной комбинированной закваски.
Сочетание микрофлоры кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий позволит повысить пробиотические свойства кисломолочных продуктов.
Объекты и методы исследований
Экспериментальные исследования проводились на кафедре «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» проблемной научно-исследовательской лаборатории Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления.
Объектами исследований служили штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freuden-reichii subsp. Shermanii КМ 186, Propionibacterium freudenreichii subsp. Freudenreichii АС-2500, Pro-pionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii АС-2503 и кефирная грибковая закваска. Штаммы пропионовокислых бактерий получены из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института
биохимии и физиологии микроорганизмов (Москва), активизированы биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государствен-ном технологическом университете.
Основные физико-химические и микробиологи-ческие показатели сырья, заквасок и кисломолочных продуктов определяли стандартными и общеприня-тыми в исследовательской практике методами.
Антимутагенную активность определяли по тесту Эймса, антибиотическую активность – методом последовательных разведений по М.С. Полонскому. Количество витамина В6 определяли микробиологи-ческим методом. Выделение витамина В6 в свободной форме достигается автоклавированием образца с растворами серной и соляной кислот различной концентрации при различном давлении и продол-жительности обработки. Для этой цели применяют также папаин, такадиастазу, кларазу [14], фермент-ный препарат из гриба Aspergillus oryzae [15].
Результаты и их обсуждение
Рост и метаболическая активность бактерий служат фундаментальными факторами для полу-чения биомассы и промышленно ценных продуктов. К этим факторам следует добавить еще одно важное свойство бактерий – биосинтез соединений, обла-дающих антимутагенным и антиканцерогенным действием.
Под антимутагенезом понимают снижение частоты спонтанной и индуцированной мутации. Анти-мутагены регулируют скорость спонтанных мутаций, стабилизируют мутационный процесс [9, 16].
В целом проблема антимутагенеза и анти-мутагенных свойств бактерий имеет большое бу-дущее, ибо включает в себя как вопросы здоровья людей, так и фундаментальные вопросы биологии.
Изучение антимутагенеза важно именно в отно-шении тех бактерий, которые используют при изготовлении пищевых продуктов. Бактерии-пробио-тики как источники антибиомутагенов или десмута-генов могут быть использованы для предобработки пищевых продуктов с целью нейтрализации мута-генных (канцерогенных) веществ.
Пропионовокислые бактерии известны выраженным антимутагенным действием. Поскольку в естественных условиях микроорганизмы постоянно подвергаются действию мутагенов, у них сформировался эндогенный и экзогенный защитные механизмы: у всех живых существ образуются молекулы, способные к осуществлению антимутагенеза. Антимутагены пропионовокислых бактерий повышают активность ферментных систем, участвующих в детоксикации поступающих в клетку веществ, оказывая влияние на окислительно-восстановительный потенциал организма, эти процессы приводят к снижению мутаций [17]. Однако антимутагенез кефирных грибков до сих пор не изучен. В связи с этим была исследована антимутагенная активность комбинированной закваски. Результаты исследований представлены в табл. 1.
Таблица 1
Определение антимутагенной активности
комбинированной закваски
|
Вид микро-организмов |
Время культивирования, ч |
Среднее число ревертантов на чашку |
Ингибирование, % |
|
Кефирная грибковая закваска |
48 |
885 |
30,0 |
|
Пропионовокислые бактерии Pr. Shermanii КМ 186 |
48 |
502 |
47,2 |
|
Комбинированная закваска |
48 |
532 |
57,8 |
В результате экспериментальных исследований установлено, что кефирная грибковая закваска обладает достаточно высокой антимутагенной активностью в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолин-N-оксидом. Следует отметить, что степень ингибирования на 17 % ниже, чем у пропионовокислых бактерий. Наиболее сильное ингибирующее действие обнаружено у комбинированной закваски. Вероятно, более высокая антимутагенная активность комбинированной закваски объясняется тем, что микроорганизмы закваски синтезируют значительные количества антиокислительных ферментов: супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы. Одновременное присутствие этих ферментов позволяет клетке удалять супероксидные и пероксидные радикалы, образованные в окислительных реакциях [18].
Таким образом, установлено, что кефирная грибковая закваска обладает выраженной антимутагенной активностью. Кроме того, введение пропионовокислых бактерий в консорциум микроорганизмов кефирной грибковой закваски повышает антимутагенные свойства комбинированной закваски.
Биологические свойства молока и молочных продуктов в значительной степени обусловливаются специфическим действием молочнокислых бактерий, которое проявляется в характере взаимоотношений между ними и в антагонистическом влиянии на постороннюю микрофлору [19].
Результаты исследований ряда авторов [20, 21] показывают, что антагонистическая активность является не только видовым, но и специфическим штаммовым признаком. В связи с этим особого внимания заслуживают исследования, направленные на изучение антибиотической активности закваски. Полученные данные сведены в табл. 2.
Как видно из данных табл. 2, при раздельном культивировании компонентов комбинированной закваски наиболее выраженной антибиотической активностью по отношению к E. Coli I53 и
Таблица 2
Антибиотическая активность заквасок
|
Вид закваски |
Рост бактерий в разведениях |
|||
|
E. coli I53 |
S. sonnei 2848 |
|||
|
Отсутст-вие роста |
Тормож-ение роста |
Отсутс-твие роста |
Тормож-ение роста |
|
|
Пропионовокислые бактерии Pr. Shermanii КМ 186 |
1:4 |
1:16 |
1:8 |
1:32 |
|
Кефирная грибковая закваска |
1:4 |
1:32 |
1:4 |
1:64 |
|
Комбинированная закваска |
1:8 |
1:64 |
1:16 |
1:128 |
Важно подчеркнуть высокую антибиотическую активность комбинированной закваски в сравнении с отдельными культурами. Бактерицидное действие комбинированной закваски по отношению к E. Coli проявлялось в разведении 1:8, а к S. Sonnei 1:16. Бактериостатическое действие закваски по отноше-нию к этим культурам отмечено в разведениях 1:16 и 1:128 соответственно.
Таким образом, установлено, что комбини-рованная закваска обладает выраженной антибио-тической активностью по отношению к патогенной микрофлоре.
Изучение пробиотических свойств комбинированной закваски наряду с другими показателями предусматривает получение данных о содержании в ней витаминов.
Молоко является хорошим источником витаминов. Известно, что содержание витаминов может значительно изменяться в процессе технологической обработки и при хранении пищевых продуктов. В связи с этим практическое решение основных проблем в области получения высококачественных продуктов питания невозможно без осуществления контроля за качественным и количественным содержанием в них витаминов.
Из всех технологических операций при производстве молочных продуктов на изменение содержания витаминов наибольшее влияние оказывает термическая обработка. По мнению ряда исследователей, тепловая обработка приводит к уменьшению большинства витаминов (и тем в большей степени, чем выше температура и продолжительность выдержки). Однако последующая ферментация молока может привести к увеличению содержания витаминов [22, 23].
Нами изучено изменение тиамина, рибофлавина и витамина В6 в процессе производства кефирного продукта. Поскольку при производстве кефирного продукта используется комбинированная закваска, проводили сравнительные исследования содержания витаминов при сквашивании молока кефирной грибковой закваской и комбинированной закваской. Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
Содержание витаминов в молочных продуктах
|
Молоко |
Количество витаминов, мкг/кг |
||
|
Тиамин (витамин В1) |
Рибофлавин (витамин В2) |
Пиридоксин (витамин В6) |
|
|
Молоко пастеризованное |
317±0,41 |
1358±0,25 |
263±0,32 |
|
Молоко, сквашенное кефирными грибками |
375±0,15 |
1741±0,11 |
315±0,17 |
|
Молоко, сквашенное пропионовокислыми бактериями |
391±0,32 |
1795±0,19 |
332±0,12 |
|
Молоко, сквашенное комбинированной закваской |
420±0,52 |
1835±0,27 |
367±0,25 |
В ходе исследований установлено, что в готовом продукте, выработанном как с использованием кефирной грибковой закваски, так и с использованием комбинированной закваски, содержание тиамина, рибофлавина и витамина В6 возрастает. Результаты исследований, представленные в табл. 3, показывают, что в результате введения пропионовокислых бактерий в кефирную грибковую закваску в кефирном продукте увеличивается содержание витаминов группы В.
Выводы
- В результате проведенных исследований установлено, что введение пропионовокислых бактерий в состав консорциума кефирной грибковой закваски повышает пробиотические свойства комбинированной закваски.
- Выявлено, что консорциум микроорганизмов пропионовокислых бактерий и кефирной грибковой закваски обладает выраженной антимутагенной активностью.
- Разработанная ассоциация микроорганизмов отличается высокой антибиотической и витамин-образующей активностью.
1. Воробьев, А.А. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины / А.А. Воробьев и др. // Вестн. Росс. АМН. - 1997. - С. 3-7.
2. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1: Микрофлора человека и жи-вотных и ее функции. - М.: Грантъ, 1998. - 286 с.
3. Коршунов, В.М. Проблемы регуляции микрофлоры кишечника // Микробиология. - 1995. - № 3. - С. 48-53.
4. Позняковский, В.Н. Гигиенические основы питания. - М.: Изд-во МГУ, 1998. - 447 с.
5. Воробьева, Л.И. Поиск пропионовокислых бактерий в кишечнике человека // Микробиология, эпидемиология, иммунология. - 1987. - № 2. - С. 7-11.
6. Воробьева, Л.И. Пропионовокислые бактерии. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 288 с.
7. Vorobjeva, L.I., Alekseeva M.A., Vorobjeva N.V. Characteristics of newly isolated strains of propionic acid bacteria // Proc 4 th Conf. Of the E.A.C. Udine. Italy, 1990. - P. 20.
8. Vorobjeva, L.I. Et al. Antimutagenicity of propionic acid bacteria // Mutat. Res. 1991. - Vol. 251. - № 6. - P. 233-239.
9. Воробьева, Л.И. Антимутагенность пропионовокислых бактерий / Л.И. Воробьева и др. // Гигиенические послед-ствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами. - Самарканд, 1990.
10. Дрожжи. Биология. Пути использования / Е.И. Квасников, И.Ф. Щелокова; отв. Ред. В.В. Смирнов; АН УССР. Ин-т микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного. - Киев: Наук. Думка, 1991. - 328 с.
11. Квасников, Е.И. Изучение нормальной микрофлоры пищеварительного тракта долгожителей Абхазии / Е.И. Квасников и др. // Феномен долгожительства. - М., 1982. - С. 111-116.
12. Микробиологические основы молочного производства: справочник / Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семе-нихина; под ред. Я.И. Костина. - М.: Агропромиздат, 1987. - 400 с.
13. Гурвич, М.М. Диетолог отвечает на вопросы. - М.: Медицина, 1988. - С. 97.
14. Storwich, C.A., J. McLeod Peters. Methods for the determination of vitamin B6 in biological materials // Vitamins and Hormones. - 1964. - V. 22. - P. 833-852.
15. Степанова, Е.Н. Определение витамина В6 в пищевых продуктах микробиологическим методом // Методы оценки и контроля витаминной обеспеченности населения. - М.: Наука, 1984. - С. 154-158.
16. Nishioka, H., Nunoshiba T. Role of enzymes in antimutagenesis of human saliva and serum // Antimutagenesis and Anti-carcinogenesis Mechanisms. N.Y.; London, 1986. - P. 143-151.
17. Воробьева, Л.И. Антимутагенность пропионовокислых бактерий / Л.И. Воробьева и др. // Микробиология. - 1991. - Т. 60. - № 6. - С. 83-89.
18. Крючкова, И.В. Влияние микрофлоры комбинированной закваски на популяцию пропионовокислых бактерий // Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности: материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2005. - С. 238.
19. Хамагаева, И.С. Научные основы биотехнологии кисломолочных продуктов для детского и диетического питания: монография. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005. - 279 с.
20. Антибиотически активные молочнокислые бактерии в производстве продуктов гарантированного качества / С.Н. Карликанова, Э.Т. Климова, С.Е. Виноградская. - М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1983. - 50 с.
21. Gilliland, S.E. And Speck M.L. Antagonistic action of Lacto-bacillus acidophilus towards intestinal and food-borne path-ogens in associative cultures // J. Food Protection. - 1987. - Vol. 40. - P. 820-823.
22. Хамагаева, И.С. Влияние пересадок на витаминобразующую способность пропионовокислых бактерий / И.С. Хамагаева, И.В. Крючкова // Новые экологобезопасные технологии для устойчивого развития регионов Сибири: материалы Всероссийской науч.-практ. конф. с международным участием. - Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005. - Т. 2. - С. 234.
23. Крючкова, И.В. Исследование витаминобразующей способности комбинированной закваски на основе кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий // Инновационные технологии в создании продуктов питания нового по-коления: материалы Всероссийской науч.-практ. конф. - Краснодар: Изд-во Технического университета, 2005. - С. 116.
