г. Тверь, Россия
УДК 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
ГРНТИ 68.35 Растениеводство
ОКСО 35.06.01 Сельское хозяйство
Исследования проводили в 2017–2019 гг. в Тверской области с целью изучения воздействия различных концентраций сахарозы и маннита на семена, незрелые зародыши, каллусные культуры льна для разработки методики получения устойчивых к осмотическому стрессу генотипов. В качестве объектов исследований использовали сорта льна Вarbara, Belinka, ЛМ-98, Aurore, Тверской, Светоч, Дипломат, Symfonia. Семена взяты из Национальной коллекции льна Федерального научного центра лубяных культур. Влияние раствора сахарозы на длину первичного корешка определяли при концентрациях – 0; 8,7; 14,9 %. Для возможности оценки энергии прорастания семян в условиях осмотического стресса концентрация сахарозы была снижена и рассматривали диапазон от 0 (контроль) до 9 %. Незрелые зародыши, извлеченные из коробочек на 10 сутки после опыления, культивировали на среде MS с сахарозой, в качестве селективного агента, в концентрации 5,0…7,0 %. Каллусные ткани культивировали с использованием в качестве осмотика маннита в концентрациях 0; 30,0; 36,4; 37,0; 37,4; 38,0 мг/л. В качестве осмотического дифференциатора для семян можно использовать концентрации 5,0, 6,0 и 7,0 % сахарозы (у сорта Belinka прорастало 10…80 % семян, у сорта Вarbara – 80…100 %, у сорта ЛМ-98 – 80…90 %). Сахароза в культуре незрелых зародышей льна in vitro в концентрации 5,0…7,0 % может быть селективным агентом только для определенных генотипов, например, сорта Aurore. Отбор устойчивых каллусных клеток с последующим формированием в меристематических очагах адвентивных почек и побегов можно проводить на средах, содержащих 30,0 либо 36,4 мг/л осмотика, на которых у всех изученных генотипов формировался морфогенный каллус, почки и побеги. У сорта Aurore в таких условиях зафиксировано 1,1…1,2 побегов/каллус, Тверской – 0,6…0,8 побегов/каллус, Barbara – 1,0…1,1 побегов/каллус
лен (Linum usitatissimum L.), сахароза, маннит, засухоустойчивость, семена, гипокотильные сегменты, незрелые зародыши
Лен-долгунец (Linum usitatissimum L.) – уникальная техническая культура, обеспечивающая сырьем многие отрасли промышленности. Выделяемые в последние годы дотации на льноводство привели к увеличению посевных площадей культуры и расширению их географии.
В последние десятилетия с использованием традиционных методов селекции достигнуты положительные результаты в направлении создания сортов, обладающих высокой потенциальной продуктивностью [1, 2, 3]. Однако из-за несовершенства и нарушения технологии возделывания, влияние неконтролируемых условий среды позволяет реализовать их потенциал не более чем на 30…35 % [4, 5].
В последние годы на значительных площадях отмечают засуху, что может быть связано с изменением климата. При этом даже непродолжительные периоды нехватки влаги (14…21 дней) в совокупности с высокими температурами могут негативно сказываться на формировании урожайности. Для выведения форм устойчивых к этому погодному явлению возможно использование методов in vitro, при условии моделирования ограниченного поступления жидкости в клетки культуры. Создание высокого осмотического потенциала в питательной среде возможно путем введения сахарозы, маннита, полиэтиленгликоля (ПЭГ).
Первое сообщение о выделении клеточных линий табака, устойчивых к стрессу, индуцированному ПЭГ, появилось в 1979 г. [6]. Позже для селекции на засухоустойчивость Р. Брессан с соавторами использовали клеточные линии томата. Для создания адаптированных к водному стрессу клеточных линий также применяли среды, содержащие в качестве осмотика маннитол [7]. Во всех системах, при определенной концентрации осмотиков, полученные клетки обладали повышенной выносливостью к засухе. Ученые России с использованием методов биотехнологии (гаплоидия, клеточная селекция) создали засухоустойчивые формы и линии яровой мягкой пшеницы [8]. Во Франции организован консорциум, в рамках которого над созданием засухоустойчивых растений работают ученые из 17 стран. Китайские исследователи с использованием методов биотехнологии создали 46 засухоустойчивых линий пшеницы, из которых 4 рекомендованы производству. В Австралии выведены засухоустойчивые формы пшеницы, обеспечивающие 20 %-ную прибавку урожая при проявлении этого лимитирующего урожайность фактора [9]. В Аргентине создан сорт сои, несущий геном устойчивости к засухе [10].
При разработке методов отбора на устойчивость к засухе в культуре in vitro целесообразно использование предварительного скрининга методом проращивания семян в концентрированных растворах осмотиков. На многих культурах была показана прямая корреляция между прорастанием семян под воздействием осмотического стресса и засухоустойчивостью [11, 12].
В связи с изложенным при выведении новых высокопродуктивных сортов льна устойчивых к стрессовым факторам среды перспективно использования биотехнологических методов.
Цель работы – оценить влияние и выявить дифференцирующие концентрации сахарозы и маннита на семена, незрелые зародыши, каллусные культуры льна для разработки методики создания устойчивых к осмотическому стрессу генотипов.
Условия, материалы и методы исследований. В качестве объектов исследований использовали сорта льна Вarbara, Belinka и ЛМ-98, Aurore, Тверской, Светоч, Дипломат, Symfonia. Семена урожая 2015 г. были взяты из Национальной коллекции льна ФГБНУ ФНЦ ЛК.
Лабораторные исследования проводили в ФГБНУ ВНИИЛ (на сегодняшний день ОП г. Торжок ФГБНУ ФНЦ ЛК) в 2017–2019 гг.
На первом этапе с целью моделирования водного стресса, семена проращивали на растворах сахарозы в чашках Петри по 50 шт. на фильтровальной бумаге в 3-х кратной повторности. Концентрация сахарозы составляла 0 (контроль), 8,7 % и 14,9 %. В ходе эксперимента оценивали способность семян формировать первичный корешок, а также его длину.
Растения доноры для получения незрелых зародышей выращивали в сосудах Митчерлиха (50 растений на сосуд) в условиях вегетационного домика на территории Научного центра. Почва была завезена с поля, предназначенного для посева льна. Уход за растениями заключался в поливе и подвязывании.
Незрелые зародыши изолировали из коробочек на 10-е сутки после цветения. Стерилизацию коробочек проводили в асептических условиях раствором этанола (70 % с экспозицией 1 мин) и хлорамина «Б» (1 % – 2 мин).
Экспланты культивировали на агаризованной среде МS, рН среды – 5,8, температура воздуха – 24 ± 1 0С, освещенность – 4000 люкс, фотопериод – 16 ч день и 8 ч ночь. Концентрация сахарозы в средах для незрелых зародышей составляла 3, 7 и 9 %. Морфогенный каллус, полученный на основе незрелых зыродышей, культивировали на средах, содержащих манит в концентрациях 0 (контроль); 30,0 мг/л; 36,4 мг/л; 37,0 мг/л; 37,4 мг/л; 38,0 мг/л. Оценку устойчивости каллусов к селективному агенту проводили по количеству сформировавшихся побегов.
Математическую обработку данных выполняли методом дисперсионного анализа с использованием пакета программ БИОСТАТ и ECXEL.
Анализ и обсуждение результатов исследований. Для отбора устойчивых к осмотическому стрессу в культуре in vitro растений-регенерантов необходимо на первом этапе подобрать оптимальную концентрацию селективного агента, которая не должна быть сублетальной, поскольку в этом случае не удастся провести отбор устойчивых клеток.
В наших исследованиях с проращиванием семян льна на растворах сахарозы в контроле уже на вторые сутки у всех генотипов наблюдали рост первичного корешка. Его длина у сорта Вarbara составляла 10,3 мм, Belinka – 12,0 мм, ЛМ-98 – 5,8 мм. В вариантах с концентрацией сахарозы 8,7 и 14,9 % рост корешков не отмечали (рисунок 1).
На шестые сутки рост корешков генотипов Вarbara и Belinka в контроле несколько снизился. У сорта ЛМ-98 в этот период наблюдали прирост корешка, по сравнению с зарегистрированным на 2-е сутки, на 5,4 мм. На 6-е сутки отмечали рост корешков в варианте с сахарозой в концентрации 8,7 %. Так, у сорта Вarbara их длина составляла 0,01 мм, Belinka – 0,2 мм, ЛМ-98 – 0,01 мм. Полное ингибирование прорастания семян всех генотипов наблюдали в варианте с содержанием сахарозы 14,9 % (см. рисунок 1 б). Поэтому дальнейший поиск селективных концентраций был продолжен в диапазоне 0 … 9 % с шагом 1 %.
Анализ результатов воздействия растворов сахарозы в указанных концентрациях свидетельствует, что прорастание семян сорта Belinka происходило во всех вариантах, Вarbara – во всех, кроме того, где содержание сахарозы в среде составляло 9 %, а у линии ЛМ-98 за исключением вариантов с концентрацией 8 и 9 % (рисунок 2). В зависимости от генотипа энергия прорастания варьировала и составляла в контроле от 60 % у сорта Belinka до 100 % у ЛМ-98, а, например, при концентрации сахарозы 4 % – от 80 % у сорта Вarbara до 90 % у двух других. По-видимому, на энергию прорастания семян льна оказывали влияние и генотипические особенности растений. При этом прямой корреляции между изменением концентрации сахарозы и энергией прорастания семян изучаемых сортов не выявлено. Так, у сорта Вarbara энергия прорастания семян при концентрациях 5, 6, 7 и 8 % составляла соответственно 20, 80, 10, 60 % при величине этого показателя в контроле 90 %. На энергию прорастания семян сорта ЛМ-98 увеличение концентрации сахарозы сказывалось незначительно – разброс величины этого показателя составлял от 100 % в контроле до 80 % в варианте с концентрацией сахарозы 7 %. Так как семена сорта Belinka прорастали во всех вариантах опыта, он был оценен, как более устойчивый к осмотическому стрессу, а ЛМ-98 и Вarbara – как менее устойчивые.
Оценка жизнеспособности семян льна при проращивании их на растворах сахарозы показала, что рост и развитие первичного корешка наблюдали у сорта Belinka во всех вариантах, Вarbara – во всех вариантах, кроме варианта с концентрацией сахарозы 9 %, у линии ЛМ-98 – кроме концентрации 8 и 9 % (табл. 1).
Наибольшая длина первичного корешка у всех сортов отмечена в контроле: Вarbara – 20,0 мм, Belinka – 41,7 мм, ЛМ-98 – 21,0 мм. С увеличением концентрации сахарозы в растворе для проращивания семян длина первичного корешка у всех генотипов снижалась. В то же время отмечено некоторое ее увеличение в вариантах с большей концентрацией сахарозы, по сравнению с меньшей. Например, у сорта Вarbara при 6,0 % сахарозы длина корешка была на 1,2…1,1 мм больше, чем при концентрации 4 и 5 %.
Реакции клеток in vivo и in vitro на стрессовые факторы, как правило, похожи, поэтому для отбора устойчивых эксплантов и клеток культивирование незрелых зародышей мы проводили на средах с концентрацией сахарозы 7 % и 9 %. В качестве контроля использовали питательные среды с содержанием сахарозы 3,0 % – оптимальной для роста и развития клеток льна-долгунца. В контроле у всех незрелых зародышей наблюдали увеличение семядолей, по сравнению с исходным, в несколько раз. У некоторых эксплантов начинала развиваться апикальная почка. Каллус получен на эксплантах всех сортов, однако активность его формирования изменялась от 43,8 % у сорта Светоч до 89,9 % у сорта Symfonia (табл. 2). Каллус характеризовался плотной консистенцией, зеленым цветом и наличием очагов новообразований.
Отмечены и сортовые отличия. Так, сорт Светоч отличался пониженной способностью формировать каллус как в контроле (3 % сахарозы), так и в вариантах с более высокими концентрациями – от 43,8 % в контроле до 2,4 % в варианте с содержанием 9 % сахарозы. Частота формирования каллусных клеток у сортов Дипломат и Symfonia составила в контрольном варианте 87 % и 92 % соответственно.
При выращивании эксплантов сорта Дипломат хорошо растущий, зеленый, морфогенный каллус был получен во всех вариантах. Частота его формирования для незрелых зародышей в контроле составила 78,4 %, а при содержании повышенных концентраций селективного агента 7,0 и 9,0 % – 56,0 и 38,4 % соответственно. Экспланты сорта Symfonia отличались наименьшей реакцией на увеличение селективной нагрузки. Можно предположить, что для этих двух сортов порог осмотического стресса находится в более высоком диапазоне концентраций сахарозы.
Для формирования комплектных растений-регенерантов очень важно при культивировании каллусов получить почки и побеги. Морфогенетическая активность у каллусов на основе незрелых зародышей разных сортов была
различной. Наименьшее количество почек и побегов отмечено у эксплантов сорта Светоч (табл. 3). На каллусах сортов Дипломат и Symfonia побеги сформировались во всех вариантах. Их количество изменялось у сорта Дипломат от 1,6 шт./каллус в контроле до 0,16 шт./каллус при концентрации сахарозы 7 %, у сорта Symfonia величина этого показателя была несколько меньше – от 1,1 до 0,29 шт./каллус соответственно. Следует отметить, что на средах с концентрацией сахарозы 9 %, число побегов было больше, чем при 7 %.
Согласно результатам этих экспериментов, можно предположить, что экспланты сортов Дипломат и Symfonia обладают большей устойчивостью к осмотическому стрессу, чем у сорта Светоч.
Представляет интерес применение других селективных агентов для получения устойчивых к водному стрессу эксплантов льна. В связи с этим в качестве осмотика использовали маннит. Исследования, проведенные на других культурах [8, 11], показали, что его оптимальная концентрация в питательной среде равна 36,4 мг/л.
В наших экспериментах морфогенный каллус формировался практически во всех вариантах у всех включенных в изучение генотипов, за исключением эксплантов сорта Тверской. У него при концентрации 38,0 мг/л маннита каллус отсутствовал (табл. 4). В контроле, а также при содержании маннита 30,0 и 36,4 мг/л наблюдали образование зеленого, плотного каллуса, с ярко выраженными меристематическими очагами, однако при добавлении маннита их количество стабильно снижалось (по сравнению с контрольными вариантами). Так, у сорта Aurore в контроле было сформировано 53,4 % морфогенных каллусов, а в варианте с 36,4 мг/л маннита – только 27,7 %. Дальнейшее снижение морфогенетической активности происходило волнообразно. При концентрации 37,0, 37,4 и 38,0 мг/л маннита, наряду с зеленым морфогенным каллусом, отмечали формирование желтого водянистого каллуса без визуально просматривающихся меристематических очагов. Аналогичную картину наблюдали в этих вариантах у сортов Тверской и Barbara. У сорта Тверской количество сформированных морфогенных каллусов уменьшилось с 77,5 % (контроль) до 17,7 % (концентрация маннита 37,4 мг/л). У сорта Barbara снижение величины этого показателя начиналось с содержания маннита 36,4 мг/л (42,2 %) и достигало 1,9 % в варианте с
38,0 мг/л маннита.
Результаты анализа свидетельствуют, что побеги в меристематических очагах формировались только в трех вариантах – в контроле, при концентрации маннита 30,0 и 36,4 мг/л. Их количество снижалось с увеличением содержания маннита в среде (табл. 5). Так, у сорта Aurore в контроле было сформировано 3,8 побегов/каллус, а в варианте с 36,4 мг/л маннита только 1,2 шт./каллус.
У сорта Тверской побегообразовательная способность была самой низкой и составляла в контроле 0,68 побегов/каллус, при концентрации маннита 30,0 мг/л – 0,8 шт./каллус; 36,4 мг/л маннита – 0,63 шт./каллус. У сорта Barbara величина этого показателя была равна соответственно 1,5, 1,1 и 1,0 шт./каллус.
Выводы. Лучше всего для определении влияния концентрации сахарозы на энергию роста и развитие корешков семян льна подходят растворы с ее содержанием 5,0, 6,0 и 7,0 %. В этих вариантах прорастало 10…80 % семян сорта Belinka, 80…100 % семян сорта Вarbara, 80…90 % семян линии ЛМ-98.
Отбор устойчивых к манниту каллусных клеток с последующим формированием в меристематических очагах адвентивных почек и побегов можно проводить на средах, содержащих 30,0 или 36,4 мг/л осмотика. Культивирование растений на средах с такой концентрацией селективного агента приводит к формированию у всех изученных генотипов морфогенного каллус, почек и побегов: у сорта Aurore – 1,1…1,2 побега на каллус, Тверской – 0,6…0,8 побега на каллус, Barbara – 1,0…1,1 побега на каллус.
1. Glutathione S-transferases and UDP-glycosyltransferases Are Involved in Response to Aluminum Stress in Flax / A. A. Dmitriev, G. S.Krasnov, T. A. Rozhmina, et al. // Front. Plant. Sci. 2016. Vol. 7. P. 1920. doi: jrg./10.3389/ fpls.2016.-1920.
2. MIR319, MIR390, and MIR393 Are involved in aluminum response in flax (Linum usitatissimum L.) / A. A. Dmitriev, A. V. Kudryavtseva, N. L. Bolsheva, et al. // Bio Med Research International. Vol. 2017. Р. 4975146. Article ID 4975146. doi:https://doi.org/10.1155/2017/4975146.
3. Внутривидовое разнообразие льна культурного (Linum usitatissimum L.) и его роль в решении проблемы сырьевого обеспечения страны // Т.А. Рожмина, А.И. Рыжов, И.А. Куземкин и др. // Достижения науки и техники АПК. 2017. Т. 31. № 12. С. 17-20.
4. Differential gene expression in response to Fusarium oxysporum infection in resistant and susceptible of flax (Linum usitatissimum L.) / A. A. Dmitriev, G. S. Krasnov, T. A. Rozhmina, et al. // BMC Plant Biol. 2017. Vol. 17. P. 253. doihttps://doi.org/10.1186/s12870-017-1192-2.
5. Урожайность льна-долгунца в длительном полевом опыте / И.И. Дмитревская, Д.С. Степанова, С.Л. Белопухов и др. // Земледелие. 2016. № 7. С. 42-44.
6. Егорова Н. А. Влияние осмотического стресса на развитие каллусных культур лаванды // Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада. 2012. Вып. 105. С. 139-143.
7. Пакуль В. Н., Плиско Л. Г. Засухоустойчивость сортов яровой мягкой пшеницы // Международный научно-исследовательский журнал. 2018. № 12 (78). Ч. 2. С. 49-52. doi:https://doi.org/10.23670/IRJ.2018.78.12.046.
8. Identification of drought tolerant wheat genotypes under water deficit conditions / Z. Chachar, N. A. Chachar, Q. I. Chachar, et al. // International Journal of Research - Granthaalayah. 2016. Vol. 4. No. 2. P. 206-214.
9. Rueda G. D. Record para la historia: tras 20 anos, la produccion de maíz superó a la de soja // Diario La Nueva SRL. [Электронный ресурс]. URL: www.lanueva.com/nota/2020-8-11-6-30-53-record-para-la-historia-tras-20-anos-la-produccion-de-maiz-supero-a-la-de-soja (дата обращения 10.09.2020).
10. Оценка адаптивности генотипов озимой пшеницы к засушливым условиям предгорной зоны центрального Кавказа / И. Р. Манукян, М. А. Басиева, Е. С. Мирошникова и др. // Аграрный вестник Урала. 2019. №5 (184). С. 17-22. doi:https://doi.org/10.32417/article_5d5151b14b9cf7.14014444.
11. Кокина Л. П., Щенникова И. Н. Зайцева И. П. Оценка коллекционных образцов ячменя на устойчивость к осмотическому стрессу // Аграрная наука Евро-Северо-Востока 2018. Т. 66. № 5. С. 40-44. doi:https://doi.org/10.30766/2072-9081.66.5.40-44.
12. Виноградова Е. Г. К разработке методики клеточной селекции получения устойчивых эксплантов льна к абиотическим факторам среды // Вестник Тверского государственного университета. Серия: Биология и экология. 2019. № 2 (54). С. 289-296. doihttps://doi.org/10.26456/vtbio92.
