г. Казань, Россия
Россия
Россия
УДК 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
ГРНТИ 68.39 Животноводство
Исследования проводили с целью изучения однонуклеотидного полиморфизма (замена Arg→Gln) в промоторной области 4 хромосомы гена параоксоназа-1 (PON1), а также выявления ассоциаций разных генотипов PON1 с показателями живой массы, молочной продуктивности и воспроизводительной способности коров-первотелок голштинской породы. Работа выполнена в 2018–2019 гг. в Республике Татарстан на 148 коровах-первотелках. Генотипирование осуществляли методом ПЦР-ПДРФ по локусу гена PON1-Bsc4I. Исследуемая популяция полиморфна, генетическое равновесие не нарушено. Распределение аллелей и генотипов было следующим: А – 0,564 и G – 0,436; АА – 31,8 % (48 гол.), GА – 49,3 % (73 гол.), GG – 18,9 % (28 гол.). Животные с генотипом GA гена PON1 были лучшими при контрольных взвешиваниях от 6 до 18 мес. и по среднесуточному приросту в период 0…18 мес. Особи этой же группы достоверно превосходили первотелок с генотипами AA и GG по таким показателям воспроизводства, как индекс плодовитости Дохи (56,2), межотельный и сервис-период (395,7 и 122 дн.), а также характеризовались самым ранним возрастом первого плодотворного осеменения (17,1 мес.). Наибольшей молочной продуктивностью за 305 дней лактации (7339,6 кг), выходом молочного жира (291,1 кг) и молочного белка (254,6 кг) характеризовались первотелки с генотипом GG. Использование при отборе и подборе родительских пар выявленных ассоциаций SNP гена PON1 c экономически важными признаками, позволит улучшить генетический потенциал потомства.
ген, генотип, параоксоназа-1, PON1, полиморфизм, первотелки, крупный рогатый скот, рост, воспроизводительные качества, удой, жир, белок
Параоксоназа-1 (PON1) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 38-45 кДа. Это Ca+-зависимая эстераза, связанная с аполипопротеином А-1 (apoA-1) в липопротеинах высокой плотности (ЛПВП) [1, 2, 3]. PON1 синтезируется исключительно в печени млекопитающих и секретируется в кровь [4]. Фермент PON1 может взаимодействовать с инсулином, стеапсином, гормоном роста, липопротеинлипазой и лептином [5, 6].
Интерес к параоксоназе-1 млекопитающих обусловлен обнаружением новых свойств фермента как антиоксиданта и детоксикатора [3, 7]. Параоксоназа-1 обладает цитопротекторными свойствами, снижающими окислительное повреждение клеточных мембран [8, 9]. Фермент PON1 способен гидролизовать специфические окисленные липиды [10], что приводит к снижению окислительного стресса в сывороточных липопротеинах, макрофагах и атеросклеротических поражениях [11]. Активность параоксоназы-1 так же связывают с овуляцией, фертильностью и здоровьем матки у коров [12, 13, 14]. В исследовании с отелившимися коровами, у животных с большей экспрессией PON1 овуляцию наблюдали раньше, чем у животных с меньшей экспрессией [13]. Кроме того, во время овуляции нарушается гомеостаз, что приводит к изменениям, которые вредны для других физиологических процессов [15]. Вследствие чего, ее сравнивают с воспалительной реакцией [16]. Таким образом, предполагается, что изменения активности циркулирующей параоксоназы-1 после отела связаны с различиями в фертильности, наблюдаемыми у лактирующих коров.
Ген bovine PON1, кодирующий одноименный фермент, расположен на 4 хромосоме и имеет длину 33168 п.о. Замена (Arg→Gln, A/G) в положении 221 во фрагменте длиной 828 п.о. области промотора гена PON1 сопряжена с реакцией острой фазы, что делает этот маркер интересным для отбора коров с лучшим ответом на воспалительные процессы в организме [17, 18]. Полиморфные варианты гена PON1 связывались авторами с динамикой живой массы в мясных и помесных породах крупного рогатого скота [19]. Идентификация различных генотипов позволит оценить влияние полиморфизма гена PON1 на фертильность, прирост живой массы и молочную продуктивность крупного рогатого скота, что в дальнейшем может использоваться в селекции.
В нашей стране также ведутся исследования полиморфизма генов-маркеров экономически важных признаков различных видов сельскохозяйственных животных с их продуктивными и другими свойствами [20, 21, 22], однако ген PON1 отечественные ученые ранее не изучали.
Цель исследования – оценить ассоциации различных генотипов по гену bovine PON1 с хозяйственно-полезными признаками коров голштинской породы.
Условия, материалы и методы исследований. Исследования проводили в СХПК «Племенной завод им. Ленина» Атнинского района Республики Татарстан и Татарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства – обособленном структурном подразделении ФИЦ «Казанский научный
центр РАН». Для выявления полиморфизма гена PON1 (Arg→Gln) методом ПЦР-ПДРФ отобрали биологический материал 148 коров-первотелок, из которого экстагировали ДНК с использованием готового набора «ДНК Сорб-Б» (ИнтерЛабСервис, Россия). Реакционную смесь, содержащую очищенную ДНК и праймеры с олигонуклеотидной последовательностью (СибЭнзим, Россия): Forward: 5' - CGGTAATCCCTGAAGAATGC -3'; Reverse: 5' - GCACTTCCTACCCCTGCTTTG -3' [17], подвергали амплификации в программируемых термоциклерах «T-100 Thermal Cycler» и «My Cycler» (Bio-Rad, США) при следующих температурно-временных режимах: денатурация – 5 мин., при 94 °С; отжиг (40 циклов) – 60 сек., при 94 °С, 60 сек., при 58 °С, 60 сек., при 72 °С; элонгация – 10 мин., при 72 °С. Дальнейшее расщепление, ПЦР-проб осуществляли в присутствии эндонуклеазы рестрикции Bsc4I (Bacillus schlegelii 4) (СибЭнзим, Россия) – изошизомер BslI (Bacillus species), предлагаемой P.A. Silvera et al. [23], BSA и буфера W (СибЭнзим, Россия) в течение 16 ч при 55 °C. Электрофоретичекое разделение выполняли в горизонтальной камере в агарозном геле 2,6 % в присутствии этидиума бромида (10 %). Выявленный полиморфизм визуализирован и документирован в системе «Gel&Doc» (Bio-Rad, США).
Частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов рассчитывали согласно методическим рекомендациям [24]. Значимость вариабельности между ожидаемым и наблюдаемым распределением генотипов гена PON1 тестировали методом хи-квадрат Пирсона (χ2) и на соответствие закону Харди-Вайнберга генетического равновесия в популяции. Из животных сформировали опытные группы в соответствии с установленными генотипами и провели исследования ассоциаций с хозяйственно-полезными признаками крупного рогатого скота.
Данные о живой массе во время контрольных взвешиваний, удое и воспроизводительных качествах брали из информационно-аналитической системы «СЕЛЭКС. Молочный скот w.6.1.0.0.» (АРМ Плинор, Россия). Анализ качественного состава молока проводили на оборудование CombiFoss™ 7, MilkoScan™ 7 RM, Fossomatic™ 7 в АО ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан. Для измерения использовали молоко, отобранное во время контрольных доек, содержащее консервант Broad Spectrum Microtabs® II.
Уровень достоверности различий определяли с использованием критерия t-Стьюдента.
Анализ и обсуждение результатов исследований. В изученной популяции были идентифицированы коровы с генотипами AA (106/252/311 п.о.), GA (90/106/221/252/311 п.о.) и GG (90/106/221/252 п.о.). Частота встречаемости аллелей A составила 0,564 и
G – 0,436 (табл. 1); генотипа AA – 31,8 % (47 гол.), GA – 49,3 % (73 гол.), GG – 18,9 % (28 гол.).
Генетическое равновесие в популяции по исследуемому гену PON1 согласно закону Харди-Вайнберга не нарушено. По результатам тестирования вариабельности между ожидаемым и наблюдаемым распределением значение величины χ2 находится ниже критического (χкрит = 5,99).
По сведениям других исследователей, частота встречаемости аллеля A гена PON1 у разных пород крупного рогатого скота в большинстве случаев была выше, чем аллеля G. Так, на породах ангус, герефорд и симментал в Китае встречаемость аллеля A варьировала от 0,515 до 0,545, G – от 0,455 до 485, среди генотипов гена PON1 по всем породам чаще всего отмечали гетерозиготный – GA (51 %) [19]. Однако по данным других китайских ученых, генотип AA практически отсутствовал в популяции помесных симментальских коров, тогда как количество представителей с гомозиготным генотипом GG достигало 84 %, соответственно, частота встречаемости аллеля G составляла 0,920, A – 0,080 [25]. P.A.S. Silveira et al., изучавшие полиморфизм в двух популяциях голштинского скота Бразилии, зафиксировали значительное доминирование аллеля A (0,603…0,798) над G (0,202…0,397). Доля животных с генотипом AA была наибольшей (64,3 и 41,1 %), далее следовали гетерозиготные (GA) особи (30,9 и 38,2 %) и первотелки с GG генотипом (4,8 и 20,6 %) [17, 23].
Живая масса, зафиксированная при рождении телят с генотипом AA, несущественно превышала величину этого показателя у особей с генотипами GA и GG соответственно на
0,6 и 0,3 кг, или 1,9 и 0,9 % (табл. 2). При этом, например, по данным A.G. Ji et al, достоверно наибольшей живой массой при рождении отличались телята пород ангус, герефорд и симментал с генотипом GA [19].
В дальнейшем во время контрольных взвешиваний в 6, 12 и 18 мес. максимальная в опыте живая масса была у телят с генотипом GA. Она превышала величину этого показателя у особей с генотипом AA соответственно на 5,1, 2,8 и 4,3 кг, с генотипом GG – на 5,4, 6,8 и 4,3 кг. В интервале 0…6 мес. наибольшие показатели абсолютного и среднесуточного прироста (142,2 кг и 790,0 г соответственно) отмечали у особей с генотипом GA, с 6 до 12 мес. – у животных с генотипом AA (145,9 кг и 810,6 г), с 12 до 18 мес. – у телят с генотипом GG (106,4 кг и 591,1 г). При этом во все периоды различия между группами были недостоверны. В среднем наибольший среднесуточный прирост с рождения до 18 месячного возраста отмечали у гетерозиготных GA-нетелей. Это соответствует результатам, представленным A.G. Ji et al., для пород ангус и симментал [19]. Следует отметить, что в наших исследованиях статистически значимых различий по живой массе между генотипами по гену PON1 не установлено.
Нетели с генотипом GA отличались самым ранним возрастом первого плодотворного осеменения, опережая сверстниц на 0,7 мес. (табл. 3). В этой же группе отмечена наименьшая живая масса при первом осеменении. Самая высокая величина этого показателя в указанный период была у особей, несущих по локусу гена PON1- Bsc4I гомозиготный аллель A – 422,6 кг. Она была выше, чем у телок с генотипом GG, на 2,3 кг (0,5 %), с генотипом GA – на 9,5 кг (2,2 %; р ˂ 0,05).
Продолжительность сервис-периода у коров с генотипом GG значительно превышала физиологическую норму (80 дн.) и была больше, чем у гетерозиготных животных, на 49,5 дн. (28,9 %; p ˂ 0,05), по сравнению с особями с генотипом AA – на 46,1 дн. (26,9 %; p ˂ 0,05).
Продолжительность межотельного периода у подопытных коров-первотелок варьировала от 395,7 до 448,3 дн., вместо желательных 365 дн. У животных с генотипом GG она была достоверной выше, чем у гетерозиготных по гена PON1 особей, на 52,6 дн. (30,7 %; p ˂ 0,05), по сравнению с первотелками с генотипом AA – на 43,6 дн. (9,7 %; p ˂ 0,05). P.A. Silvera et al. ранее отмечали наименьшую активность параоксоназы-1 в сыворотке крови гетерозиготных (GA) коров. У этих же животных наблюдали наименьшую длительность межотельного периода, а самым продолжительным он был у особей с генотипом GG [23].
Незначительная вариабельность индекса Дохи (52,3…56,2) в целом свидетельствует о высокой фертильности изучаемого поголовья. Наибольшая величина этого показателя отмечена у гетерозиготных по гену PON1 особей, она была достоверно выше, чем у первотелок с генотипом GG, на 3,9 (или 6,9 %; p ˂ 0,05).
Самый высокий удой за первую стандартную лактацию (305 дн.) наблюдали у животных с генотипом GG по гену PON1 (табл. 4). Он был выше, чем у гетерозиготных сверстниц, на 1370,9 кг (17,7 %; p ˂ 0,001), а по сравнению с особями с генотипом AA – на 1025,5 кг (13,2 %; p ˂ 0,001).
Анализ влияния полиморфизма гена PON1 на качественный состав молока показал, что наибольшим выходом молочного жира и белка характеризуются коровы-первотелки с генотипами GG. Это, в первую очередь, связано с повышенным уровнем их молочной продуктивности. У животных с генотипом AA величины этих показателей были достоверно меньше соответственно на 39,9 кг (13,7 %; p ˂ 0,001) и 33,7 кг (13,2 %; p ˂ 0,001), у гетерозиготных особей – на 50,3 кг (17,3 %; p ˂ 0,001) и 41,2 кг (16,2 %; p ˂ 0,001).
Выводы. Частота встречаемости аллеля A по локусу гена PON1-Bsc4I в исследуемой популяции составляла 0,564, G – 0,436, генотипов GA – 49,3 % (73 гол.) AA – 31,8 %
(47 гол.), GG – 18,9 % (28 гол.). Изменение живой массы нетелей в зависимости от генотипа по гену PON1 установлено только на уровне тенденций.
Молочная продуктивность коров по первой стандартной лактации (305 дн.) была больше у животных с генотипом по исследуемому гену GG. У таких первотелок удой достоверно превышал величину этого показателя у сверстниц с генотипами АА и GA в среднем на 1025,5…1370,9 кг (13,2…17,7 %), выход молочного жира за лактацию – на 39,9…50,3 кг (13,7…17,3 %), молочного белка – на 33,7…41,2 кг (13,2…16,2 %).
У коров с желательным по молочной продуктивности гомозиготным генотипом GG, уровень фертильности в целом был ниже, чем у остального поголовья. Статистически значимая разница (p ˂ 0,05) с другими группами животных по продолжительности межотельного и сервис-периода составила 46,1…49,5 и 43,6…52,6 дн. соответственно, по индексу Дохи – 1,1…3,9 ед.
Cведения об источнике финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания: Мобилизация генетических ресурсов растений и животных, создание новаций, обеспечивающих производство биологически ценных продуктов питания с максимальной безопасностью для здоровья человека и окружающей среды. Номер регистрации: АААА-А18-118031390148-1.
1. Identification of a distinct human high-density lipoprotein subspecies defined by a lipoprotein-associated protein, K-45. Identity of K-45 with paraoxonase / M.C. Blatter, R.W. James, S. Messer, et al. // European Journal of Biochemistry. 1993. Vol. 211. P. 871-879.
2. Enzymatic assessment of paraoxonase 1 activity on HDL subclasses: a practical zymogram method to assess HDL function / A. Gugliucci, R. Caccavello, K. Kotani, et al. // Clinica Chimica Acta. 2013. Vol. 415. P. 162-168.
3. Ефимцева Э.А., Челпанова Т.И. Параоксоназа: молекулярно-генетические аспекты и клиническое значение // Успехи современной биологии. 2012. Т. 132. № 3. С. 282-296.
4. Paraoxonase: biochemistry, genetics and relationship to plasma lipoproteins / M.I. Mackness, B. Mackness, P.N. Durrington, et al. // Current Opinion in Lipidology. 1996. Vol. 7(2). P. 69-76.
5. Association between IGF-I, IGF-IR and GHRH gene polymorphisms and growth and carcass traits in beef cattle / R.A. Curi, H.N.de Oliveirab, A.C. Silveira, et al. // Livestock Production Science. 2005. No. 94. P. 159-167.
6. Effects of GHR gene polymorphisms on growth and carcass traits in Zebu and crossbred beef cattle / R.A. Curi, D.A. Palmieria, L.Suguisawa, et al. // Livestock Science. 2006. Vol. 101. P. 94-100.
7. HDL-associated paraoxonase-1 can redistribute to cell membranes and influence sensitivity to oxidative stress / S.P. Deakin, S. Bioletto, M.-L. Bochaton-Piallat, et al. // Free Radical Biology and Medicine. 2011. Vol. 50. P. 102-109.
8. Cho K.H. A reconstituted high density lipoprotein containing the V156E mutant of apolipoprotein A-I exhibits anti-atherosclerotic activity in Apo-E deficient mice // Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 2009. Vol. 16(3). P. 217-229.
9. Fuhrman B. , Gantman A., Aviram M. Paraoxonase 1 (PON1) deficiency in mice is associated with reduced expression of macrophage SR-BI and consequently the loss of HDL cytoprotection against apoptosis // Atherosclerosis. 2010. No. 211(1). P. 61-68.
10. Aviram M., Rosenblat M. Paraoxonases and cardiovascular diseases: pharmacological and nutritional influences // Current Opinion in Lipidology. 2005. No. 16(4). P. 393-399.
11. Paraoxonase (PON1) deficiency is associated with increased macrophage oxidative stress: studies in PON1-knockout mice / O. Rozenberg, M. Rosenblat, R. Coleman, et al. // Free Radical Biology and Medicine. 2003. No. 34(6). P. 774-784.
12. Schneider A., Correa M.N., Butler W.R. Short communication: acute phase proteins in Holstein cows diagnosed with uterine infection // Research in Veterinary Science. 2013. Vol. 95. P. 269-271.
13. Associations between resumption of postpartum ovarianactivity, uterine health and concentrations of metabolites andacute phase proteins during the transition period in Holstein cows / A.R.T. Krause, L.F.M. Pfeifercd, P. Montagnerad, et al. // Animal Reproduction Science. 2014. Vol. 145. P. 8-14. doi:https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2013.12.016.
14. Rincón J.A.A. Exogenous paraoxonase-1 during oocyte maturation improves bovine embryo development in vitro // Reproduction in Domestic Animals. 2016. No. 51(5). P. 1-4. doi:https://doi.org/10.1111/rda.12730
15. The periovulatory period in cattle: progesterone, prostaglandins, oxytocin and ADAMTS proteases / J.E. Fortune E.L. Willis, P.J. Bridges et al. // Animal Reproduction. 2009. No. 6. P. 60-71.
16. Espey, L.L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction // Biology of Reproduction. 1994. Vol. 50. P. 233-238.
17. Characterization of single nucleotide polymorphisms in the promoter region of the bovine paraoxonase 1 (PON1) gene affecting serum enzyme activity in dairy cows / P.A.S. Silveira, E. Schwegler, P. Montagner, et al. // The Veterinary Journal. 2015. Vol. 205(1). P. 101-103. doi:https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2015.04.028.
18. Wedel A., Ziegler-Heitbrock H.W. The CEBP family of transcription factors // Immunobiology. 1995. No. 193(2-4). P. 171-185.
19. Association between PON1 Gene SNPs and Growth and Carcass Traits in Beef Cattle / A.G. Ji, Y.H. Huai, Z.K. Zhou, et al. // Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 2008. Vol. 21 No. 8. P. 1097-1102.
20. Studying the association of polymorphic variants of LEP, TG5, CSN3, LGB genes with signs of dairy productivity of cattle / F.F. Zinnatov, F.F. Zinnatova, A.H. Volkov, et al. // International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences. 2020. Т. 11. No 2. P. 1428-1432.
21. Характеристика быков-производителей с разными генотипами диацилглицерол-о-ацилтрансферазы по происхождению / С.В. Тюлькин, Л.Р. Загидуллин, Т.М. Ахметов, и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2017. Т. 230. № 2. С. 155-158.
22. Молекулярная диагностика полиморфизма генов ESR и PRLR, влияющих на репродуктивные качества свиней / И.И. Гиниятуллин, Л.А. Рахматов, Т.М. Ахметов и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2016. Т. 225. № 1. С. 107-108.
23. Polymorphisms in the anti-oxidant paraoxonase-1 (PON1) gene associated with fertility of postpartum dairy cows / P.A.S. Silveira, W.R. Butler, S.E. la Count, et al. // Theriogenology. 2019. Vol. 125. P. 302-309. doi:https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2018.11.024.
24. Меркурьева Е.К., Шангин-Березовский Г.Н. Генетика с основами биометрии. М.: Колос, 1983. 400 c.
25. Identification of Polymorphisms in the Bovine Paraoxonase 1 Gene / J. Zhang, S. Zhao, Z. Lei, et al. // Journal of Animal and Veterinary Advances. 2013. Vol. 12 (2). P. 229-233. doi:https://doi.org/10.36478/javaa.2013.229.233.
