Статья посвящена совершенствованию элементов технологии клонального микроразмножения сорта винограда Пухляковский с целью повышения эффективности его содержания в коллекции in vitro. Исследовали введение в состав культуральной среды осмотически активного вещества ‒ сорбит в диапазоне концентраций 5…30 г/л, в сравнении с сахарозой 10 г/л. Исследования проводили в 2021‒2022 гг. на коллекции растений винограда in vitro Всероссийского научно-исследовательского института виноградарства и виноделия имени Я.И. Потапенко (Ростовская область). Культивирование осуществляли в условиях освещеннности 3,0 тыс. лк, температура +25 °С, фотопериод 16/8 ч, влажность воздуха 60 %. Оценивали морфометрические параметры побегов – количество и длина побегов, высота побега, количество листьев. Отмечено ингибирование ростовых процессов во всех опытных вариантах, в сравнении с контролем. Лучшие показатели сохранности зафиксированы в варианте с конценрацией сорбита 10 г/л. Худшую сохранность наблюдали в контроле (43,3 %) и варианте с максимальным в опыте содержанием сорбита 30 г/л (36,7 %). Проведен расчет экономической эффективности содержания растений в коллекции in vitro на среде с сахарозой и сорбитом. Депонирование на среде с сорбитом экономичнее на 17 % благодаря увеличению интервала между субкультивированиями с 6 до 12 месяцев. Установлено положительное влияние препарата сорбит на сохранность и качественные характеристики растений. Лучшая сохранность (86,7 %) и умеренное торможение роста зафиксированы в варианте с концентрацией препарата 10 г/л. Она оказалась оптимальной для использования при депонировании растений винограда сорта Пухляковский в коллекции in vitro в условиях замедленного роста.
виноград (Vitis), сохранение биоразнообразия, коллекция in vitro, микроклональное размножение, сорбит.
Введение. Сохранению генофонда винограда посвящено немало исследований во многих странах [1, 2, 3].
Наряду с традиционными методами, в последние годы все большее значение приобретают коллекции генофонда в виде изолированных тканей и органов in vitro. Они имеют ряд неоспоримых преимуществ и активно создаются по всему миру как альтернативный и дополнительный инструмент в системе мер по сохранению генофонда растений [4, 5, 6].
Достоинство таких коллекций – здоровые растения без вирусный и фитомикоплазменных инфекций, что повышает продуктивность виноградников, качество винограда и вина, долговечность насаждений, устойчивость к неблагоприятным факторам среды. Возможность проведения работ в течение года сокращает продолжительности селекционного процесса. Потребность в площадях и трудозатраты ниже в сравнении с содержанием полевых коллекций [7].
Содержание растений в условиях in vitro – направление дорогое. Однако ввиду того, что на сегодняшний день его относят практически к единственному надежному способу производства здорового посадочного материала и сохранения генофонда – затраты оправдывают себя. Важное направление исследований в области биотехнологии хранения растений – снижение себестоимости процесса. Один из способов уменьшения затрат – хранение растений in vitro в условиях замедленного роста. . Это позволяет снизить трудозатраты и расход материалов и компонентов культуральных сред. Кроме того, снижение частоты пересадок способствует повышению сохранности, так как субкультивирование сопровождается риском заражения и является стрессом для растения [8‒9].
Один из способов снижения затрат – увеличение периода между пересадками путем снижения частоты субкультивирований вследствие уменьшения скорости роста растений [10].
Поиск приемов, позволяющих изменить кинетику роста и увеличить время между субкультивированиями ‒ актуальная задача, которую в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института виноградарства и виноделия имени Я.И. Потапенко решают с использованием антибиотиков, углеводов и физических параметров культивирования [11].
Условия для замедленного роста создаются, например, путем применения осмотиков – веществ, имитирующих для растений недостаток влаги. Действие водного стресса выражается в снижении скорости ростовых процессов, угнетении фотосинтеза и дыхания, снижении ферментной активности, изменении соотношения минеральных веществ. К числу осмотически активных веществ относят сорбит – органический шестиатомный спирт, который получают путём гидрирования глюкозы с восстановлением альдегидной группы до первичной спиртовой [12].
Ранее было изучено влияние сорбита на растения винограда сортов Агат донской, Восторг, Каберне Совиньон. В этих исследованиях отмечено стимулирование ростовых процессов при его минимальных концентрациях (5…7,5 г/л) и минимизация скорости роста при повышенных (10…60 г/л) [13].
Цель исследования – определить концентрации сорбита для снижения скорости роста растений винограда сорта Пухляковский в условиях in vitro.
Условия, материалы и методы. Работу проводили в стационарных условиях лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института виноградарства и виноделия ‒ филиале Федерального Ростовского аграрного научного центра на коллекции винограда in vitro по общепринятым в биотехнологии методикам.
Пробирочные растения, выращенные in vitro, после второго субкультивирования скальпелем разделяли на сегменты стебля с одним узлом, которые использовали в качестве вторичных эксплантов. Их высаживали на модифицированную среду Мурасиге–Скуга. Культивирование проводили в пробирках размером 200 × 20 мм. Схема опыта включала 6 вариантов: добавление в питательную среду сорбита в концентрациях 5; 7,5; 10; 20; 30 г/л; контроль ‒ сахароза 10 г/л. Повторность трехкратная, по 10 растений.
Условия культивирования были следующими: освещение 3,0 тыс. лк, температура 25 °С, фотопериод 16/8 ч, влажность воздуха 60 %. Оценивали количество и длину побегов, количество листьев. Ризогенную зону измеряли до достижения растениями возраста 6 месяцев. Далее измерить корни без извлечения растений из пробирки не представлялось возможным, поэтому данные по количеству и длине корней, а также длине ризогенной зоны в учетах после 205 суток культивирования отсутствуют.
Для расчета показателей экономической эффективности применяли расчетно-конструктивный метод (Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / П. Я. Голодрига, В. А. Зленко, Л. А. Чекмарев и др. Ялта: ВНИИВиПП "Магарач"1986. 56 с.; Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур / В. И. Кашин, А. А. Борисова, Ю.Н. Приходько и др. М.: Издательство: Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии, 2001. 100 с.). Расчет затрат на содержание в коллекции in vitro 10000 шт. растений на протяжении 12 месяцев был проведен в ценах 2021 г.
Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли методом дисперсионного анализа (Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Колос, 1965. 424 с.).
Результаты и обсуждение. По всем вариантам опыта отмечена высокая приживаемость растений 76,7…100 %. Их сохранность, спустя год беспересадочного содержания в коллекции in vitro на среде с сорбитом в концентрациях 5…20 г/л, была выше, чем в контроле, на 27…43 % и составляла 70…86,7 %. Максимальная в опыте сохранность зафиксирована при использовании 10 г/л сорбита. Худшей (36,7 %) она была в варианте с максимальным в опыте содержанием сорбита ‒ 30 г/л (табл. 1).
Таблица 1 – Влияние различного содержания сорбита в составе питательной среды на растения сорта Пухляковский (2021 г.)
|
Вариант, г/л |
Сохранность, % |
Корни |
Высота, см |
||
|
число, шт. |
длина, см |
ризогенная зона, см |
|||
|
Учет через 60 суток культивирования |
|||||
|
Контроль сахароза |
93,3 |
2,1 |
5,6 |
11,8 |
7,3 |
|
5,0 |
76,7 |
1,5 |
4,0 |
6,0 |
5,2 |
|
7,5 |
96,7 |
1,6 |
4,8 |
7,7 |
6,0 |
|
10,0 |
100,0 |
1,7 |
5,7 |
9,7 |
5,7 |
|
20,0 |
90,0 |
1,4 |
6,4 |
8,9 |
4,2 |
|
30,0 |
83,3 |
1,3 |
5,7 |
7,2 |
3,6 |
|
НСР05 |
20,8 |
2,2 |
0,3 |
0,9 |
1,1 |
|
Учет через 97 суток культивирования |
|||||
|
Контроль сахароза |
93,3 |
2,2 |
6,2 |
13,6 |
10,2 |
|
5,0 |
73,3 |
1,6 |
5,1 |
8,1 |
7,9 |
|
7,5 |
96,7 |
1,6 |
5,8 |
9,2 |
9,0 |
|
10,0 |
100 |
1,7 |
7,1 |
12,0 |
9,2 |
|
20,0 |
90,0 |
1,4 |
7,8 |
10,9 |
7,8 |
|
30,0 |
83,3 |
1,3 |
7,5 |
9,8 |
7,3 |
|
НСР05 |
15,8 |
0,9 |
2,0 |
2,2 |
1,9 |
|
Учет через 130 суток культивирования |
|||||
|
Контроль сахароза |
93,3 |
2,2 |
6,9 |
15,1 |
12,5 |
|
5,0 |
73,3 |
1,5 |
6,1 |
9,1 |
11,3 |
|
7,5 |
96,7 |
1,6 |
6,1 |
9,8 |
11,7 |
|
10,0 |
100,0 |
1,7 |
7,0 |
11,9 |
11,5 |
|
20,0 |
90,0 |
1,5 |
8,4 |
12,6 |
10,6 |
|
30,0 |
83,3 |
1,5 |
8,2 |
12,3 |
8,6 |
|
НСР05 |
15,6 |
0,9 |
3,1 |
2,4 |
1,5 |
|
Учет через 205 суток культивирования |
|||||
|
Контроль сахароза |
90,0 |
– |
– |
– |
15,2 |
|
5,0 |
73,3 |
– |
– |
– |
15,6 |
|
7,5 |
96,7 |
– |
– |
– |
14,2 |
|
10,0 |
100,0 |
– |
– |
– |
14,7 |
|
20,0 |
90,0 |
– |
– |
– |
14,7 |
|
30,0 |
83,3 |
– |
– |
– |
11,7 |
|
НСР05 |
15,6 |
|
|
|
1,5 |
|
Учет через 288 суток культивирования |
|||||
|
Контроль сахароза |
73,3 |
– |
– |
– |
16,8 |
|
5,0 |
70,0 |
– |
– |
– |
16,3 |
|
7,5 |
96,7 |
– |
– |
– |
16,2 |
|
10,0 |
100,0 |
– |
– |
– |
14,7 |
|
20,0 |
83,3 |
– |
– |
– |
15,8 |
|
30,0 |
73,3 |
– |
– |
– |
14,1 |
|
НСР05 |
21,1 |
|
|
|
0,9 |
|
Учет через 324 суток |
|||||
|
Контроль сахароза |
43,3 |
– |
– |
– |
17,0 |
|
5,0 |
70,0 |
– |
– |
– |
17,0 |
|
7,5 |
93,3 |
– |
– |
– |
16,6 |
|
10,0 |
86,7 |
– |
– |
– |
16,7 |
|
20,0 |
80,0 |
– |
– |
– |
16,6 |
|
30,0 |
53,3 |
– |
– |
– |
15,3 |
|
НСР05 |
17,2 |
|
|
|
1,6 |
|
Учет через 371 сутки |
|||||
|
Контроль сахароза |
43,3 |
– |
– |
– |
17,0 |
|
5,0 |
70,0 |
– |
– |
– |
17,0 |
|
7,5 |
83,3 |
– |
– |
– |
16,8 |
|
10,0 |
86,7 |
– |
– |
– |
17,0 |
|
20,0 |
70,0 |
– |
– |
– |
17,0 |
|
30,0 |
36,7 |
– |
– |
– |
16,0 |
|
НСР05 |
27,3 |
|
|
|
4,0 |
Уменьшение сохранности отмечали с 9 месяца культивирования по достижению растениями высоты 16 см (высота пробирки). На протяжения всего периода культивирования очень четко просматривалось снижение интенсивности ростовых процессов под действием сорбита во всех вариантах опыта, по сравнению с контролем.
Количество корней в вариантах с сорбитом было ниже, чем в контроле. Так, в возрасте 60 суток число корней в контроле составляло в среднем 2,1 шт. на растение. При добавлении в питательную среду сорбита величина этого показателя снижалась до 1,3 (30 г/л)…1,7 (10 г/л) шт. на растение. Эта закономерность сохранялась на протяжении всего периода учета корневой зоны (до 6 месяцев культивирования). Четкой зависимости длинны корней от вида и концентрации углевода не зафиксировано. Однако размер ризогенной зоны в вариантах с сорбитом был меньше, чем в контроле. Так, при учете после 60 суток наибольший размер ризогенной зоны (11,8 см) зафиксирован в контроле, наименьший (6,0 см) – в варианте с содержанием сорбита 5 г/л. В дальнейшем эта закономерность сохранялась. После 97 и 130 суток культивирования максимальный среди вариантов размер ризогенной зоны отмечали в контроле (13,6 см и 15,1 см соответственно), наименьший ‒ при самом низком содержании сорбита в среде (8,1 см и 9,1 соответственно). Уменьшение размеров ризогенной зоны происходило вследствие снижения количества корней.
Высота растений в вариантах с сорбитом была меньше, чем в контроле, и снижалась по мере увеличения концентрации сорбита. Максимальной в опыте она была в контроле, самой низкой ‒ в варианте с концентрацией сорбита 30 г/л. Так, в контроле при учете в возрасте 60 суток средняя высота растений составила 7,3 см, при максимальном в опыте содержании сорбита (30 г/л) она была наименьшей ‒ 3,6 см. При учете через 288 суток культивирования в контроле высота растений была равна 16,8 см, в вариантах с сорбитом ‒ от 14,1 см (30 г/л) до 16,3 см (5 г/л). В контроле растения достигли максимально возможной высоты (16 см ‒ размер пробирки) после 9 месяцев культивирования. Далее требовалась пересадка. Из-за снижения скорости роста на среде с сорбитом растения достигали размера пробирки позже и дольше не требовали субкультивирования, что позволяет увеличить время беспересадочного хранения до 12 месяцев.
Следует отметить отличное состояние растений в вариантах с сорбитом. В контроле в возрасте 3 месяца они занимали три четверти пробирки (см. рисунок, а), в то время, как при концентрации сорбита в среде 30 г/л – не более половины пробирки (см. рисунок, б). В экспериментальных вариантах происходило торможение ростовых процессов, но растения оставались жизнеспособными с прямостоящими плотными стеблями ярко-зелёными листьями без признаков угнетения.
|
|
|
А |
|
|
|
Б |
Рисунок – Влияние сорбита на интенсивность ростовых процессов и жизнеспособность растений сорта Пухляковский.
а – контроль, б – сорбит 30 г/л
Увеличение периода между пересадками позволит снизить затраты на содержание коллекции. Предполагаемый экономический эффект складывается из уменьшения расходов на оплату труда (подготовка химической посуды, приготовление культуральной среды, посадка), приобретение предметов снабжения и расходных материалов. Замена в составе культуральных сред сахарозы сорбитом в той же концентрации (10 г/л) позволит снизить затраты на содержание коллекции на 17 % (табл. 2).
Таблица 2 – Смета затрат на содержание в коллекции 10 000 растений 1 год, тыс. руб
|
Статья затрат |
Интервал между пересадками
|
|
|
9 месяцев |
12 месяцев |
|
|
Оплата труда Начисления на фонд оплаты труда (35,0 %) |
263,1
92,1 |
175,396
64,9 |
|
Оплата коммунальных услуг: отопление и технологические нужды потребление электроэнергии водоснабжение помещений содержание помещений |
91,3 246,8 139,7 0,3 |
91,3 246,8 139,7 0,3 |
|
Приобретение предметов снабжения и расходных материалов: расходные материалы реактивы и регуляторы роста мягкий инвентарь |
75,0 15,9 7,5 |
50,0 11,4 5,0 |
|
Прочие текущие расходы на закупку товаров и оплата услуг: текущий ремонт оборудования текущий ремонт зданий и сооружений |
5,0 10,0 |
5,0 10,0 |
|
Итого прямые затраты |
946,7 |
799,8 |
|
Накладные расходы (25 % от оплаты труда и начислений на ФОТ) |
88,8 |
60,1 |
|
Стоимость затрат на выращивание 10 000 растений |
1035,5 |
859,9 |
|
Себестоимость одного растения |
0,1 |
0,09 |
Выводы. Сорбит не оказал отрицательного влияния на приживаемость растений винограда сорта Пухляковский, которая варьировала от 76,7 до 100 % независимо от концентрации осмотика. Максимальная сохранность после 12 месяцев хранения отмечена в варианте с концентрацией сорбита 10 г/л (86,7 %). Это дает основание считать такую концентрацию оптимальной для культивирования растений винограда сорта Пухляковский в коллекции in vitro в условиях замедленного роста.
Использование сорбита в такой концентрации позволяет увеличить эффективность содержания растений винограда сорта Пухляковский в коллекции in vitro на 17 %.
1. Cantizano J., Garcia de Lujan A., Arroyo-Garcia R. Molecular characterization of table grape varieties preserved in the Rancho de la Merced Grapevine Germplasm Bank (Spain) // Vitis. 2018. Vol. 57. No. 3. Р. 93-101.
2. Micropropagation and in vitro germplasm conservation of Georgian wild grape-vines / D. Maghradze, R. Ocete, J. L. García, et al. // Vitis. 2015. Vol. 54 (Special Issue). Р. 257-258.
3. Vitis vinifera L. germplasm diversity: a genetic and ampelometric study in ancient vineyards in the South of Basilicata region (Italy) / T. Labagnara, C. Bergamini, A.R. Caputo, et al. // Vitis. 2018. Vol. 57. No. 1. Р. 1-8. URL: https://ojs.openagrar.de/index.php/VITIS/article/view/8358 (дата обращения: 14.10.2022).
4. Новикова Т. И. Использование биотехнологических подходов для сохранения биоразнообразия растений // Растительный мир Азиатской России. 2013. № 2(12). С. 119-128.
5. Guiding principles for identification, evaluation and conservation of Vitis vinifera L. sbsp.sylvestris / G. Zdunic, E. Maul, J. E. Eiras Diasetc, at al. // Vitis. 2017. Vol. 56. No. 3. Р. 127-131.
6. Melyan G. Sahakyan A., Harutyunyan A. Micropropagation of grapevine (Vitis Vinifera L.) seedless cultivar 'Parvana' through lateral bud development // Vitis. 2015. Vol 54 (Special Issue). P. 253-255.
7. Дорошенко Н.П., Трошин Л.П., Алзубайди Х.К. Биотехнология - наука и отрасль сельского хозяйства // Научный журнал КубГАУ. 2016. №116(02). С. 1700-1732.
8. Самарская В.О., Малаева Е.В., Постнова М.В. Аспекты клонального микроразмножения и сохранения растений in vitro // Природные системы и ресурсы. 2019. Т. 9. № 3. С. 13-22.
9. Морфо-биологические особенности формирования диафрагмы у in vitro и ex viro растений винограда межвидового происхождения / С. В. Акимова, В. В. Киркач, А. К. Раджабов и др. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2021. № 6. С. 5-13.
10. Патент № 2743965 C1 Российская Федерация, МПК A01H 4/00. Способ длительного депонирования in vitro растений малины ремонтантной: № 2020119115: заявл. 09.06.2020 : опубл. 01.03.2021 / В. В. Киркач, С. В. Акимова, Н. Н. Малеванная и др.; заявитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева».
11. Патент № 2764104 C1 Российская Федерация, МПК A01H 4/00. Способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro: № 2021111285: заявл. 20.04.2021 : опубл. 13.01.2022 / Н. П. Дорошенко, В. Г. Пузырнова; заявитель Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный Ростовский аграрный научный центр».
12. Кутас Е. Н., Горецкая А. А. Влияние осмотических ингибиторов на снижение скорости роста и сохранение жизнеспособности стерильных культур // Весці Нацыянальнай Акадэміі Навук Беларусі. Серыя Біялагічных Навук. 2013. № 4. С. 24-29.
13. Дорошенко Н. П., Пузырнова В. Г. Влияние осмотика сорбит на ростовые процессы винограда в культуре in vitro // Плодоводство и виноградарство Юга России. 2020. № 64 (4). С. 190-209.
