Цель исследования – проведение морфологической и молекулярно-генетической идентификации и изучение филогенетической взаимосвязи среди видов протостронгилид. Материалы и методы. Гельминтологический материал собирали от диких и домашних полорогих и наземных моллюсков рода Xeropicta в предгорно-горных зонах Узбекистана. Морфологию протостронгилид изучали методами Боева (1975) и Anderson (1978). Для определения вида нематод готовили временные препараты, обработанные глицерином. Личинок первой стадии изучали путем исследования проб фекалий животных с учетом длины, формы хвоста и размера тела. Для изучения морфологии личинок третьей стадии протостронгилид отделяли ножки у зараженных моллюсков Xeropicta candaсharica и помещали их в искусственный желудочный сок, где разрушался чехлик и освобождались инвазионные личинки. После определения видовой принадлежности половозрелых и личиночных стадий нематод материал хранили в отдельных пробирках с дистиллированной водой при низких температурах (- 20 ºС) или в 70%-ном этаноле для молекулярного анализа. В работе использованы микроскопы ML 2000 с цифровой камерой и Olympus CX31. Выделение ДНК, амплификацию и секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе. Филогенетический анализ проводили при помощи програмного обеспечения ClustalX 2.0. Филогенетические деревья построены при помощи метода присоединения соседей NJ (Neighbor–Joining method). Для сравнения филогенетического анализа использованы нуклеотидные последовательности ITS-2 участка видов Protostrongylus rufescens (EU018485), P. shiozawai (AB478249), Ortostrongylus macrotis (EU018483), Cystocaulus ocreatus (EU018481) и Umingmakstrongylus pallikuukensis (AY648409), которые получены из Генбанка (NCBI GenBank). Результаты и обсуждение. Обнаружены половозрелые нематоды четырех видов протостронгилид: Protostrongylus rufescens, P. hobmaieri, Spiculocaulus leuckarti и Cystocaulus ocreatus. ДНК четырех видов половозрелых протостронгилид и личинок была амплифицирована с использованием ITS-2 региона. Размер амплификатов у нематоды P. rufescens и P. hobmaieri составил 380 пар нуклеотидов (п. н.), S. leuckarti – 388, C. ocreatus – 399. По результатам филогенетического анализа и сравнения нуклеотидных последовательностей у Caprinae выявлено 5 видов протостронгилид: Protostrongylus rufescens, P. hobmaieri, Protostrongylus sp., Spiculocaulus leuckarti и Cystocaulus ocreatus. Морфологический и молекулярно-генетический анализ выявленных нематод позволяет провести их точную идентификацию.
Protostrongylidae, полорогие, моллюски, DNA, ITS-2, нуклеотидная последовательность.
Цель исследования — проведение морфологической и молекулярно-генетической идентификации и изучение филогенетической взаимосвязи среди видов протостронгилид.
Материалы и методы. Гельминтологический материал собирали от диких и домашних полорогих и наземных моллюсков рода Xeropicta в предгорно-горных зонах Узбекистана. Морфологию протостронгилид изучали методами Боева (1975) и Anderson (1978). Для определения вида нематод готовили временные препараты, обработанные глицерином. Личинок первой стадии изучали путем исследования проб фекалий животных с учетом длины, формы хвоста и размера тела. Для изучения морфологии личинок третьей стадии протостронгилид отделяли ножки у зараженных моллюсков Xeropicta candaсharica и помещали их в искусственный желудочный сок, где разрушался чехлик и освобождались инвазионные личинки. После определения видовой принадлежности половозрелых и личиночных стадий нематод материал хранили в отдельных пробирках с дистиллированной водой при низких температурах (- 20 ºС) или в 70%-ном этаноле для молекулярного анализа. В работе использованы микроскопы ML 2000 с цифровой камерой и Olympus CX31. Выделение ДНК, амплификацию и секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе. Филогенетический анализ проводили при помощи програмного обеспечения ClustalX 2.0. Филогенетические деревья построены при помощи метода присоединения соседей NJ (Neighbor–Joining method). Для сравнения филогенетического анализа использованы нуклеотидные последовательности ITS-2 участка видов Protostrongylus rufescens (EU018485), P. shiozawai (AB478249), Ortostrongylus macrotis (EU018483), Cystocaulus ocreatus (EU018481) и Umingmakstrongylus pallikuukensis (AY648409), которые получены из Генбанка (NCBI GenBank).
Результаты и обсуждение. Обнаружены половозрелые нематоды четырех видов протостронгилид: Protostrongylus rufescens, P. hobmaieri, Spiculocaulus leuckarti и Cystocaulus ocreatus. ДНК четырех видов половозрелых протостронгилид и личинок была амплифицирована с использованием ITS-2 региона. Размер амплификатов у нематоды P. rufescens и P. hobmaieri составил 380 пар нуклеотидов (п. н.), S. leuckarti – 388, C. ocreatus – 399. По результатам филогенетического анализа и сравнения нуклеотидных последовательностей у Caprinae выявлено 5 видов протостронгилид: Protostrongylus rufescens, P. hobmaieri, Protostrongylus sp., Spiculocaulus leuckarti и Cystocaulus ocreatus. Морфологический и молекулярно-генетический анализ выявленных нематод позволяет провести их точную идентификацию. Ключевые слова: Protostrongylidae, полорогие, моллюски, DNA, ITS-2, нуклеотидная последовательность. Введение Нематоды семейства Protostrongylidae Leiper, 1926 – своеобразная группа нематод, паразитов респираторной системы жвачных и зайцеобразных. В семействе протостронгилид к настоящему времени описано 60 видов, отдельные популяции которых зарегистрированы в Европе, Азии, Америке, Африке и Австралии [1–7]. В Узбекистане у полорогих зарегистрировано 15 видов паразитов [2–4]. В биологическом отношении нематоды семейства Protostrongylidae занимают особое положение среди родственных групп. Они в процессе эволюции на всех стадиях своего развития перешли к обитанию в условиях суши. Половозрелые нематоды паразитируют у наземных млекопитающих, а личинки развиваются в наземных моллюсках, выполняющих роль промежуточных хозяев. В организме этих моллюсков, развиваются личинки второй и третьей стадий [2, 3]. Данные по молекулярному анализу нематод этой группы ограничены. В частности, убедительных фактов, касающихся частичных последовательностей из малой и большой субъединицы рибосомальной ДНК у Protostrongylidae, не обнаружено [8]. Посредством ограниченного анализа последовательностей рибосомальных ДНК 18S и 28S, выделенных из представителей таксонов Strongylida, были выведены различия в монофилии протостронгилид внутри Metastrongylina [9]. Проведены анализы на более низких таксономических уровнях, исследующие как ядерные, так и митохондриальные локусы или конформационный полиморфизм. Уделялось внимание разработке диагностики применения в географически экстенсивных регионах [9–11] или оценке генетического разнообразия видов и популяций [12, 13]. На основе сравнений и сходства последовательностей второго внутреннего транскрибирующего спейсера (ITS-2) были идентифицированы виды 7 родов протостронгилид, эндемичных для Северной Америки [11]. Дифференцированный анализ с использованием молекулярных маркеров (ядерных и митохондриальных) является крайне важным вкладом в изучении полевых коллекций взрослых паразитов и личинок. Корреляция молекулярных последовательностей между взрослыми (подтвержденной сравнительной морфологией) и личиночными стадиями паразитов приведет к первоначальной точной идентификации видов рода Protostrongylus и других протостронгилид. К настоящему времени не удалось обнаружить достоверных диагностических морфологических признаков сходства в строении личинок первой стадии (L1 - в фекалиях и окружающей среде) и личинок второй и третьей стадий (L2, L3 – в промежуточном хозяине) [3, 11]. Целью наших исследований было проведение морфологической и молекулярно-генетической идентификации и изучение филогенетической взаимосвязи среди видов протостронгилид
1. Азимов Д. А., Акрамова Ф. А., Хусанов А., Кучбоев А. Э. Структура и функционирование нематод семейства Protostrongylidae Leiper,1926 // Докл. АН РУз. - Ташкент, 1998. - №10. - С. 39-41.
2. Боев С. Н. Основы нематодологии. Протостронгилиды. - М.: Наука, 1975. - Т. 25. - 266 с.
3. Контримавичус В. Л., Делямуре С. Л., Боев С. Н. Основы нематодологии. Метастронгилоидеи домашних и диких животных. - М.: Наука, 1976. - Т. 26. - 239 с.
4. Кулмаматов Э. Н., Исакова Д. Т., Азимов Д. А. Гельминты позвоночных горных экосистем Узбекистана. - Ташкент: Фан, 1994. - 151 с.
5. Кучбоев А. Э. Популяционная экология, систематика нематод семейства Protostrongylidae Leiper, 1926 и функционально-метаболические процессы в системе “паразит-хозяин”: Автореф. дис... д-ра биол. наук. - Ташкент, 2009. - 43 с.
6. Рузиев Б. Х. Ассоциативная инвазия протостронгилидами овец и морфо-функциональные взаимоотношения в системе «паразит-хозяин»: Автореф. дис. … канд. биол. наук. - Ташкент, 2008. - 21 с.
7. Anderson R. C., Chabaud A. G., Willmott S. Key to genera of the superfamily Metastrongyloidea. - No. 5. CIN Keys to the nematode parasites of vertebrates. - Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK. - 1978. - Р. 1-40.
8. Carreno R. A., Nadler S. A. Phylogenetic analysis of the Metastrongyloidea (Nematoda: Strongylida) inferred from ribosomal RNA gene sequences // J. of Parasitology. - 2003. - Vol. 89. - P. 965-973.
9. Chilton N. B., Huby-Chilton F., Gasser R. B., Beveridge I. The evolutionary origins of nematodes within the order Strongylida are related to predilection sites within hosts // Molecular Phylogenetics and Evolution. - 2006. - Vol. 40. - P. 118-128.
10. Jenkins E. J., Appleyard G. D., Hoberg E. P. et al. Geographic distribution of the muscle-dwelling nematode Parelaphostrongylus odocoilei in North America, using molecular identification of first stage larvae // J. of Parasitology. - 2005. - Vol. 91. - P. 574-584.
11. Kutz S. J., Asmundsson I., Hoberg E. P. et al. Veitch ASerendipitous discovery of a novel protostrongylid (Nematoda: Metastrongyloidea) in caribou (Rangifer tarandus), muskoxen (Ovibos moschatus) and moose (Alces alces) from high latitudes of North America based on DNA sequence comparisons // Canadian J. of Zoology. - 2007. - Vol. 85. - P. 1143-1156.
12. Mortenson J. A., Abrams A., Rosenthal B. et al. Parelaphostrongylus odocoilei in Columbian black-tailed deer from Oregon // J. of Wildlife Diseases. - 2006. - Vol. 42. - P. 527-535.
13. Asmundsson I., Mortenson J., Hoberg E. P. Muscleworms, Parelaphostrongylus andersoni (Nematoda: Protostrongylidae), discovered in Columbia white-tailed deer from Oregon and Washington: Implications for biogeography and host associations // J. of Wildlife Disease. - 2008. - Vol. 44. - P. 16-27.
14. Larkin M. A., Blackshields G., Brown N. P. et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. // Bioinformatics. - 2007. - Vol. 23. - P. 2947-2948.
