Россия
УДК 57.085.2 Эксперименты на изолированных или трансплантированных органах или тканях, эксперименты in vitro
Исследования проводили с целью оптимизации условий культивирования для второго этапа клонального микроразмножения Thymus caucasicus Willd. и Thymus serpullum L. Сегменты стебля с одним узлом (8…10 мм), полученные при микрочеренковании побегов, культивировали на 10 различных питательных средах Мурасиге и Скуга (МС), содержащих 2 % сахарозы и 0,8 % агар-агара, с добавлением кинетина, тидиазурона, бензиламинопурина (БАП), индолилуксусной и гибберелловой кислот. При микроразмножении использовали различные культуральные сосуды (банки, колбы, пробирки). Продолжительность цикла выращивания варьировала от 40 до 70 сут. Самый высокий коэффициент размножения у T. serpyllum отмечали на среде МС с содержанием 1,0 мг/л БАП и составляет 6,7, T. caucasicus – на среде МС с 1,0 мг/л кинетина (16,1). Наибольшая эффективность культивирования обеих видов тимьяна достигалась в банках, при использовании которых коэффициент размножения был выше, чем при выращивании в пробирках или колбах, в 1,4…2,1 раза. Изучаемые виды тимьяна целесообразно культивировать при стандартном цикле 40 сут. Лучшие сочетания различных факторов размножения тимьяна способствовали максимальному проявлению морфогенетического потенциала в экспериментах in vitro. Наибольшее влияние на коэффициент размножения оказывали тип культурального сосуда, взаимодействие состава питательной среды и генотипа, а также состав питательной среды (доли влияния факторов составляли от 20,0 % до 25,3 %). Результаты исследований послужили основой разработки протокола, который можно использовать для ускоренного микроразмножения T. caucasicus и T. serpullum,.
тимьян ползучий (Thymus serpullum L.), тимьян кавказский (Thymus caucasicus Willd.), клональное микроразмножение, in vitro, регуляторы роста
Введение. В последние годы в медицине огромное значение уделяют фитопрепаратам. Внимание учёных сосредоточено на растениях рода Thymus, эфирное масло которых применяют в качестве мочегонных, антиоксидантных, успокаивающих, жаропонижающих, а также противосудорожных лекарственных средств. Имеются сведения об использовании препаратов из этого растения в виде мазей и компрессов при болях в суставах, ревматизме и при кожных заболеваниях [1, 2]. В эфирном масле ряда видов Thymus содержится ценное фенольное соединение – тимол, которое обладает бактерицидным, противовирусным, противогрибковым и противовоспалительным действием [3, 4, 5]. Существуют научные исследования, в которых описывается применение тимьяна при нарушениях работы пищеварительной системы, а также как вспомогательное средство для выведения желчи [6]. Издавна известно использование настоев и отваров из растительного сырья тимьяна, как лекарственных средств, обладающих отхаркивающим и антисептическим действием. Поэтому их включают в терапии заболеваний дыхательной системы (бронхита, ларингита, ангины и трахеита) [7, 8].
В последние десятилетия все больше видов сельскохозяйственных растений размножают с привлечением приемов культуры in vitro, которые позволяют повысить эффективность традиционного размножения и получить растения, оздоровленные от грибных, бактериальных, а при использовании хемо- или термотерапии, и вирусных инфекций. Методы микроразмножения также необходимы при разработке биотехнологий депонирования растений в условиях in vitro [9, 10].
Для достижения эффективности процесса микроразмножения in vitro необходимо оптимизировать состав питательной среды для каждого этапа и подобрать оптимальные условия культивирования, такие как продолжительность цикла выращивания, тип культурального сосуда и другие факторы. При этом для каждого вида или даже сорта растения разрабатывают конкретную методику клонального размножения [11, 12].
При анализе литературных источников по микроразмножению видов рода Thymus не было выявлено данных о комплексном влиянии условий культивирования на морфогенетический потенциал эксплантов. Отсутствуют публикации о зависимости коэффициента размножения тимьяна in vitro от продолжительности цикла выращивания и типа культурального сосуда. Кроме того, описанные в научных работах результаты отечественных и зарубежных ученых, касающиеся состава регуляторов роста в питательной среде и других вопросов, довольно противоречивы [13, 14]. Экпланты T. sibthorpii, по данным авторов, необходимо культивировать на безгормональной питательной среде [15]. В большинстве публикаций отмечают, что наивысший коэффициент размножения достигается в вариантах, где питательная среда содержит цитокинины. Так, для T. pallidus необходимо добавление кинетина или аденина [16], для T. serpyllum – совместно БАП и кинетина [17], для Thymus vulgaris – изопентиладенина [18]. Применение существующих протоколов размножения тимьяна при работе с новыми видами или образцами затруднено из-за отсутствия унифицированных методических подходов.
Цель исследования – оценка влияния гормонального состава питательной среды и условий культивирования на морфогенез эксплантов двух видов рода Thymus для разработки методики микроразмножения in vitro.
Условия, материалы и методы. В ходе исследования в качестве исходных взяты растения тимьяна ползучего (Thymus serpullum L.) и тимьяна кавказского (Thymus caucasicus Willd.), которые были выращены в условиях закрытого грунта. Растения T. serpyllum получены из коллекции генофонда пряно-ароматических, эфиромасличных и лекарственных растений ФГБУН «НИИСХ Крыма» (УНУ № 507515), а T. caucasicus – из коллекции Южно-Уральского ботанического сада-института Уфимского федерального исследовательского центра РАН.
В ходе работы применены общепринятые методы культуры органов и тканей растений [10, 11]. Для введения в культуру in vitro использовали ранее оптимизированные для этих видов растений питательные среды Мурасиге и Скуга (МС) [19].
На этапе собственно микроразмножения в условиях ламинарного бокса проводили микрочеренкование полученных при введении in vitro побегов. Выделенные сегменты стебля с одним узлом длиной 8…10 мм выращивали на модификациях питательной среды МС (фактор А), с добавлением кинетина (Кин.), тидиазурона (ТДЗ), бензиламинопурина (БАП), индолилуксусной кислоты (ИУК), гибберелловой кислоты (ГК3) (Sigma, CША), 2 % сахарозы и 0,8 % агар-агара (Fujian Putian, Китай). Состав регуляторов роста в питательной среде был выбран на основании наших предварительных исследований микроразмножения тимьяна обыкновенного [20]. Для выращивания эксплантов использовали разные культуральные сосуды – пробирки (15×160 мм), стеклянные банки (200 мл) и колбы (200 мл), закрытые фольгой.
Культивирование осуществляли при +24…+26 °С, относительной влажности воздуха 70 % и освещенности 2…3 тыс. люкс с фотопериодом 16 часов. На 30-, 40-, 50-, 60- и 70-е сутки цикла выращивания анализировали различные параметры: длину и число микропобегов и корней, количество узлов на побеге, количество оводненных микропобегов и другие. Для расчета коэффициента размножения количество сформированных побегов умножали на число узлов на побеге.
Повторность эксперимента – 3-кратная, количество эксплантов в каждой повторности – 20. Изучение влияния факторов на различные параметры микроразмножения проведено с использованием 2-факторных лабораторных опытов. Для статистической обработки данных применяли методы вариационной статистики (пакет программ Microsoft Office, Excel 2010). В таблицах и на графиках представлены средние арифметические и их ошибки на 5 %-ном уровне значимости.
В отдельном заключительном эксперименте для определения доли влияния отдельных факторов на коэффициент размножения проведен дисперсионный анализ (с использованием программы Statistica 10.0) влияния 4 факторов: генотипа (2 вида тимьяна), состава питательной среды (6 вариантов среды МС), типа культурального сосуда (пробирки, колбы, банки), продолжительности цикла выращивания (30, 40, 50, 60, 70 сут).
Результаты и обсуждение. На втором этапе размножения in vitro на микрорастениях формировались пазушные и адвентивные побеги. На эффективность этого этапа влиял генотип, состав питательной среды, а также условия культивирования – тип используемого для выращивания сосуда и продолжительность цикла выращивания.
Состав питательной среды. При сравнении числа побегов на 1 эксплант на питательных средах разного гормонального состава выявлен рост величины этого параметра у T. serpullum при культивировании на среде МС, содержащей 1,0 мг/л БАП или 1,0 мг/л ТДЗ (рис. 1а), по сравнению со средами с добавлением кинетина. У T. caucasicus отмечено достоверное повышение числа побегов при использовании безгормональной среды МС или введении в состав питательной среды кинетина, по сравнению с добавлением БАП или ТДЗ.
Анализ зависимости длины побега (рис. 1б) от типа и содержания регуляторов роста в питательной среде МС выявил, что максимального значения этот показатель у обоих видов достигал при использовании 1,0 мг/л кинетина. Применение в качестве цитокинина БАП или ТДЗ способствовало снижению длины микропобегов в 2,4…4,8 и 2,4…2,7 раза, по сравнению с кинетином, соответственно.
Рис. 1 – Количество (а) и длина побегов (б) при микроразмножении двух видов тимьяна на различных питательных средах.
Для T. caucasicus оптимальной оказалась среда МС с добавлением кинетина в количестве 1,0 мг/л. Так, на этой среде при оптимальных условиях культивирования коэффициент размножения достигал 16,1.
При использовании БАП или ТДЗ у T. caucasicus наблюдали образование витрифицированных микропобегов с частотой от 41,3 до 49,3 % (табл. 1). Полученные результаты указывают на нерациональность применения указанных регуляторов роста для этого вида.
Таблица 1 – Коэффициент размножения и частота витрификации побегов 2-х видов тимьяна в зависимости от состава питательной среды
|
Регуляторы роста в среде МС, мг/л |
Коэффициент размножения |
Частота витрификации, % |
||
|
T. caucasicus |
T. serpullum |
T. caucasicus |
T. serpullum |
|
|
МС без гормонов |
13,5±1,5 |
3,0±0,3 |
0 |
0 |
|
Кин. – 1,0 |
16,1±1,6 |
6,0±0,5 |
0 |
0 |
|
Кин. – 1,0; ГК3 – 1,0 |
14,4±2,0 |
6,0±0,4 |
11,2±1,3 |
0 |
|
Кин –1,0; ИУК–0,5 |
13,5±1,5 |
3,0±0,3 |
0 |
0 |
|
БАП –1,0 |
2,3±0,3 |
6,7±0,6 |
49,3±5,1 |
0 |
|
БАП–1,0; ГК₃ –1,0 |
4,5±0,3 |
6,2±0,6 |
78,3±7,1 |
21,2±2,3 |
|
БАП–1,0; ИУК–0,5 |
2,5±0,3 |
4,8±0,6 |
67,7±6,1 |
8,2±0,9 |
|
ТДЗ – 1,0 |
4,6±0,3 |
6,8±0,5 |
41,3±4,8 |
56,3±6,2 |
|
ТДЗ–1,0; ГК₃ –1,0 |
5,4±0,5 |
9,6±0,5 |
82,4±8,8 |
82,6±7,3 |
|
ТДЗ–1,0; ИУК–0,5 |
4,2±0,3 |
6,8±0,5 |
59,6±5,8 |
56,3±6,2 |
При выращивании эксплантатов T. serpyllum отмечены значительные коэффициенты размножения (от 6,8 до 9,6) при использовании сред с тидиазуроном. Однако применение этого цитокинина как и в случае с T. caucasicus вызывало аналогичные нежелательные проявления в асептической культуре (витрификацию побегов от 56,3 до 82,6 %). В связи с этим мы рекомендуем воздержаться от использования этих сред для T. serpyllum.
У тимьяна ползучего на среде МС с 1,0 мг/л БАП оводненные побеги не формировались и коэффициент размножения достигал максимального значения – 6,7. Поэтому мы считаем эту среду оптимальной для микрораразмножения T. serpyllum.
Культуральный сосуд. Для оценки влияния условий культивирования на этапе собственно микроразмножения экспланты культивировали в пробирках, колбах и банках. Анализ представленных на рис. 2 данных показал, что количество побегов на 1 эксплант в банках было в 2,0…3,7 раза выше, по сравнению с культивированием в пробирках или колбах, на оптимальных для каждого вида тимьяна питательных средах. При добавлении в среду МС ТДЗ величина этого показателя была на одном уровне при использовании всех трех анализируемых типов культуральных сосудов.
Рис. 2 – Количество побегов на 1 эксплант в зависимости от культурального сосуда и состава регуляторов роста в питательной среде при микроразмножении двух видов тимьяна.
У T. сaucasicus в банках наблюдали меньше узлов на питательных средах с кинетином или БАП, по сравнению с культивированием в пробирках или колбах (рис. 3, 4). При этом у T. serpyllum отмечена тенденция повышения величины этого показателя при использовании банок.
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
Рис. 3 – Культивирование T. serpyllum (а – банки; б – колбы; в – пробирки) и T. сaucasicus (г – банки; д – колбы; е – пробирки).
Рис. 4 – Количество узлов на побеге в зависимости от культурального сосуда и состава регуляторов роста в питательной среде при микроразмножении двух видов тимьяна.
Анализ изменения коэффициента размножения в зависимости от типа культурального сосуда показал значительное его повышение при использовании банок (рис. 5). Так, при культивировании эксплантов на оптимальной питательной среде с кинетином в банках коэффициент размножения был выше у T. caucasicus в 1,4…1,9 раза, а у T. serpullum в 2,0…2,1 раза, по сравнению с пробирками или колбами.
Рис. 5 – Коэффициент размножения двух видов тимьяна в зависимости от культурального сосуда и состава регуляторов роста в питательной среде.
Продолжительность цикла выращивания. В нашими предыдущих исследованиях с Т. vulgaris показано, что при увеличении длительности цикла выращивания до 70 сут. коэффициент размножения возрастал в 3,2 раза, по сравнению со стандартным циклом (40 сут.) [20]. У T. caucasicus и T. serpullum при культивировании эксплантов более двух месяцев также происходило повышение коэффициента размножения в 1,3 и 1,8 раза, однако достоверных различий при сравнении циклов выращивания разной длительности не установлено.
Рис. 6 – Коэффициент размножения двух видов тимьяна в зависимости от продолжительности цикла выращивания in vitro.
Генотип. В ходе изучения клонального микроразмножения было выявлено, что влияние таких лимитирующих факторов, как состав питательной среды и условия культивирования, проявлялось по-разному у изученных видов тимьяна. Более высокий коэффициент размножения отметили у T. caucasicus. При сочетании оптимальных условий этот параметр достигал 16,1 (см. табл. 1). При культивировании T. serpullum коэффициент размножения был в 2,4…2,5 раза ниже.
Согласно результатам дисперсионного анализа 4-факторного лабораторного эксперимента, на величину наиболее важного параметра «коэффициент размножения» наибольшее влияние оказывали тип культурального сосуда (доля влияния 25,3 %), питательная среда (20,0 %), а также взаимодействие факторов «генотип» и «питательная среда» (20,8 %) (рис. 7).
Рис. 7 – Доля влияния генотипа, питательной среды, культурального сосуда и длительности цикла выращивания на коэффициент размножения тимьяна.
Доля влияния генотипа на коэффициент размножения T. caucasicus и T. serpullum составляла 10,6 %, а продолжительности культивирования в цикле выращивания ‒ всего лишь 3,8 %, или была несущественной.
Выводы. Максимальный в экспериментах коэффициент размножения T. caucasicus (16,1) отмечен при добавлении в питательную среду 1,0 мг/л кинетина, T. serpullum (6,7) – при добавлении 1,0 мг/л БАП. Наиболее эффективным было выращивание эксплантов тимьяна in vitro в стеклянных банках, которое обеспечивало повышение коэффициента размножения в 1,4…2,1 раза, по сравнению с использованием пробирок или колб. При микроразмножении T. caucasicus и T. serpullum целесообразно использовать стандартный цикл выращивания 40 суток. Коэффициент размножения тимьяна в наибольшей степени зависел от типа культурального сосуда (доля влияния 25,3 %), состава питательной среды (20,0 %) и взаимодействия генотипа и состава питательной среды (20,8 %).
1. Брага П. К. Тимол: антибактериальная, противогрибковая и антиоксидантная активность // Гинекология. 2009. № 4 С. 61‒66.
2. Aljabeili H. S., Barakat H., Abdel-Rahman H. A. Chemical composition, antibacterial and antioxidant activities of Thyme essential oil (T. vulgaris) // Food and Nutrition Sciences. 2018. Vol. 9. P. 433‒446. doi:https://doi.org/10.4236/fns.2018.95034.
3. Содержание и антимикробная активность эфирных масел в траве тимьяна Маршалла и тимьяна ползучего / А. С. Шереметьева, А. В. Фролкова, О. Г. Шаповал и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2021. T. 24. ¹ 3. С. 27–32. doi:https://doi.org/10.29296/25877313-2021-03-04.
4. Antimicrobial, antibiofilm and biochemichal properties of Thymus vulgaris essential oil against clinical isolates of opportunistic infections / M. V. Kryvtsova, I. Salamon, J. Koscova, et al. // Biosystems Diversity. 2019. Vol. 27. No. 3. P. 270–275. doi:https://doi.org/10.15421/011936.
5. Biological Properties of Essential Oils from Thymus algeriensis Boiss. / H. Ouakouak, A. Benarfa, M. Messaoudi, et al. // Plants. 2021. Vol. 10. No. 4. P. 786 URL: https:// doi.org/10.3390/plants10040786 (дата обращения: 25.06.2023). doi:https://doi.org/10.3390/plants10040786.
6. Винокурова О. А., Тринеева О. В., Сливкин А. И. Сравнительная характеристика различных видов тимьяна: состав, свойства, применение (обзор) // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016. № 4 (17). С. 134–150.
7. Бубенчикова В. Н., Старчак Ю. А. Изучение отхаркивающей активности растений рода Тимьян // Медицинский вестник Башкортостана. 2013. Т. 8. № 5. С. 78–80.
8. Княжеская Н. П., Бобков Е. В. Фитопрепараты в терапии респираторных заболеваний // Медицинский совет. 2019. № 15. С. 70–76. doi:https://doi.org/10.21518/2079-701X-2019-15-70-76.
9. Калашникова Е. А. Клеточная инженерия растений. М.: Юрайт, 2020. 333 с.
10. Cardoso J. C., Gerald L. T. S., Teixeira da Silva J. A. Micropropagation in the Twenty-First Century // Plant cell culture protocols (4th edition) / Eds.: V. M. Loyola-Vargas, N. Ochoa-Alejo. New York: Humana Press, 2018. P. 17–46. doi:https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8594-4_2.
11. Методология биотехнологических исследований цветочно-декоративных культур: коллективная монография / под общ. ред. И. В. Митрофановой. Симферополь: Ариал, 2018. 268 с. doi:https://doi.org/10.32514/978-5-907118-58-4.
12. Егорова Н. А. Биотехнология эфиромасличных растений: создание новых форм и микроразмножение in vitro. Симферополь: Автограф, 2021. 315 с. doi:https://doi.org/10.33952/2542-0720-2021-978-5-6045452-9-4.
13. Banna H. Y. Micropropagation of thyme plant (Thymus vulgaris) // Journal of Plant Production, Mansoura University. 2017. Vol. 8. No. 11. P. 1221–1227. doi:https://doi.org/10.21608/JPP.2017.41294.
14. Alcowni R., Solyman E., Qauod H. Introducing some of threatened Thymus species to in vitro tissue culturing as an approach for their conservation // Pakistan Journal of Botany. 2017. Vol. 49. No. 1. P. 259‒264.
15. Micropropagation and molecular characterization of Thymus sibthorpii Benth. (Lamiaceae), an aromatic-medicinal thyme with ornamental value and conservation concern / G. Tsoktouridis, N. Krigas, V. Sarropoulou, et al. // In Vitro Cellular and Developmental Biology ‒ Plant. 2019. Vol. 55. P. 647–658. doi:https://doi.org/10.1007/s11627-019-10000-y.
16. Conservation of Thymus pallidus Cosson ex Batt. by shoot tip and axillary bud in vitro culture / Z. N. Ansari, I. Boussaoudi, R. Benkaddour, et al. // Journal of Plant Biotechnology. 2020. Vol. 47. P. 53–65. doi:https://doi.org/10.5010/JPB.2020.47.1.053.
17. Khajuria A. K., Bisht N. S., Bhagat N. In vitro organogenesis and plant regeneration of Thymus serpyllum L.: an important aromatic medicinal plant // In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 2020. Vol. 56, P. 652–661 doi:https://doi.org/10.1007/s11627-020-10094-9
18. Kulpa D., Wesołowska A., Jadczak P. Micropropagation and composition of essentials oils in garden Thyme (Thymus vulgaris L.) // Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca. 2018. Vol. 46. No. 2. P. 525‒532. doi:https://doi.org/10.15835/nbha46211020.
19. Тевфик А. Ш., Егорова Н. А., Коваленко М. С. Влияние лимитирующих факторов на развитие эксплантов Thymus serpyllum L. и Thymus caucasicus Willd. на первом этапе микроразмножения in vitro // Таврический вестник аграрной науки. 2023. № 1 (33). С.113–124. doi:https://doi.org/10.5281/zenodo.7898524.
20. Тевфик А. Ш., Егорова Н. А. Влияние условий культивирования и гормонального состава питательной среды на микроразмножение in vitro тимьяна обыкновенного // Таврический вестник аграрной науки. 2019. № 1 (17). C. 93–102. doi:https://doi.org/10.33952/2542-0720-2019-1-17-93-102
