Болезни органов дыхания являются серьезной медико-социальной проблемой, что определяется их значимостью в уровне детской заболеваемости, младенческой смертности, инвалидизации больных [1, 11]. По данным многочисленных исследований отмечается неуклонный рост числа детей и подростков, больных хроническими воспалительными заболеваниями легких (ХНЗЛ), трудно поддающимися лечению и склонными к рецидивированию [5, 14]. В основе патогенеза большинства ХНЗЛ лежит длительно текущий воспалительный процесс, формирующийся в структурно измененной ткани легких и бронхов вследствие врожденных дефектов или других причин. Обычно они появляются в результате нарушения эмбрионального формирования бронхолегочных структур, но не исключается влияние заболеваний легких, возникающих в постнатальном периоде, на дифференцировку структур бронхолегочной системы и формирование хронического бронхолегочного процесса [7].
Очень сложно обнаружить единственную причину хронизации воспалительного процесса, но одной из наиболее частых причин нарушения энергетического баланса является гипоксия. Она характеризуется нарушением клеточного дыхания, недостаточностью биологического окисления и дефицитом энергетики в организме [12]. Изучение недостаточности цитоэнергетического статуса организма может служить одной из важнейших патогенетических аспектов расшифровки молекулярных механизмов реализации локального и системного воспаления при ХНЗЛ.
По данным литературы, около 15-20% детей имеют нарушения клеточной энергетики [15]. Метаболическая чувствительность может варьировать в процессе онтогенеза и клинические проявления могут появиться только в подростковом возрасте, в связи с возрастающими метаболическими потребностями [9]. На сегодняшний день активно расширяется круг доказательств важной роли митохондриальных дисфункций в патогенезе заболеваний различных органов и систем. Так, помимо первичных митохондриальных болезней, связанных с мутациями ядерной или митохондриальной ДНК, выделяют состояния, характеризующиеся вторичной митохондриальной дисфункцией, которые могут встречаться при разнообразной патологии, вследствие присутствия митохондрий практически во всех клетках организма [15].
Информативным подходом к оценке биоэнергетики является измерение мембранного потенциала митохондрий (МПМ, Δψ). Дыхательная цепь митохондрий снабжает клетку энергией, трансформируя энергию окисления субстратов дыхания в форму трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране. Поддержание мембранного потенциала служит индикатором «здоровья» митохондрий и уровня метаболической активности клеток. Во внутренней мембране митохондрий находятся элементы дыхательной цепи, в том числе и сукцинатдегидрогеназа, поэтому нарушение процессов энергообразования может изменять трансмембранный протонный потенциал [8, 19]. МПМ не имеет постоянного значения. Он может изменяться под воздействием многих внутриклеточных биохимических процессов, а также внешних раздражителей [2]. Снижение МПМ свидетельствует о повреждении клетки, сопровождается высвобождением из межмембранного пространства широкого спектра апоптогенных факторов (прокаспаз 2, 3 и 9, апоптоз-индуцирующего фактора AIF, вторичного митохондриального активатора апоптоза SMAC, цитохрома С и др.), определяющих реализацию программированной гибели клетки. Падение величины МПМ является одним из основных показателей инициации митохондриального пути запуска апоптоза [13, 17, 18]. Установлена прямая взаимосвязь между нарушением потребления кислорода клетками крови, развитием гипоксии и состоянием митохондриального аппарата клетки у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких [10], у детей с внебольничной пневмонией [4].
Определение МПМ – один из наиболее отвечающих требованиям метод исследования функционального и энергетического состояния живой клетки, так как он позволяет одномоментно проанализировать нарушение МПМ у 5000-25000 лимфоцитов.
С этих позиций нами было предпринято исследование, целью которого стало совершенствование диагностики нарушений клеточной энергетики у детей с ХНЗЛ в стадии ремиссии методами определения цитохимических изменений энергетического статуса и учета процента иммунокомпетентных клеток крови с пониженным МПМ.
Материалы и методы исследования
Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации «Рекомендации для врачей по биомедицинским исследованиям на людях» (2013). Дизайн исследования одобрен решением Этического комитета Хабаровского филиала ДНЦ ФПД – НИИ ОМИД. Для решения поставленных в работе задач проводились:
- Анализ анамнестических и клинических данных наблюдаемых 77 больных в возрасте от 1 года до 17 лет (средний возраст 9,2±3,2 лет), с длительностью заболевания от 1 года до 14 лет (в среднем 6,4±2,3 лет). Диагноз ставился в соответствии с классификацией клинических форм бронхолегочных заболеваний у детей, утвержденной XVIII Национальным конгрессом по болезням органов дыхания. В соответствии с этой классификацией дети с пороками развития легких (ВПРЛ) составили самую многочисленную группу – 66 человек (83%). У обследованных детей выявлены следующие ВПРЛ (табл. 1).
Таблица 1
Структура морфологических форм ВПРЛ (n=66)
|
Нозология |
абс. (%) |
|
Гипоплазия доли легкого |
36 (54,5) |
|
Аплазия доли легкого |
2 (3) |
|
Синдром Вильямса-Кэмпбелла |
2 (3) |
|
Кистозная гипоплазия |
6 (9) |
|
Бронхоэктатическая болезнь |
7 (11) |
|
Легочная секвестрация |
5 (7,5) |
|
Аномалия строения бронхиального дерева |
3 (4,5) |
|
Недифференцированные тканевые пороки |
5 (7,5) |
Вторую группу составили 11 детей (17%) с ХНЗЛ как исходом острых/хронических заболеваний легких. Критерии отбора: верифицированный диагноз хронического заболевания, отсутствие обострений в течение 3 мес.
Контролем послужили показатели 23 здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту.
- Инструментально-лабораторное обследование детей. Больным выполнено полное клиническое обследование, по показаниям проводилось морфологическое исследование, бронхоскопия/бронхография, спиральная компьютерная томография.
- Определение активности дегидрогеназ – сукцинатдегидрогеназы (СДГ), α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) – проводили количественным методом по Р.П.Нарциссову (1969), основанным на реакции восстановления солей тетразолия и выпадения осадка диформазана в местах активности фермента. Активность дегидрогеназ выражалась средним числом гранул в одной клетке (гр./кл.). Кроме того, был рассчитан коэффициент вариации (V) – степень разнородности клеток по активности фермента.
- Определение МПМ проводили в гепаринизированной крови с использованием красителя JC-1 (5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3' тетраэтилбензимидазолкарбоцанин иодид/хлорид) (Becton Dickinson, США). JC-1 является катионным красителем, поглощение которого митохондриями напрямую связано с величиной МПМ [19]. Способ осуществляют следующим образом: 800 мкл гепаринизированной крови наслаивается на 400 мкл фиколл-верографина, центрифугируется при 1500 об/мин в течение 15 минут, собирается лимфоцитарное кольцо, которое центрифугируется 5 минут при 1000 об/мин, надосадочная жидкость сливается. Клетки окрашиваются красителем JC-1, после чего инкубируются 15 минут при температуре 37ºС, затем дважды промываются буфером, после чего подвергаются анализу на цитометре BD FАCS Calibur (США) в программе Cell Quest Pro.
- Статистическая обработка материала проведена на персональном компьютере c применением пакета статистических программ: STATISTICAR для Windows (версия 10.0) и пакет «Анализ данных» для Microsoft Excel 2007 и включала описательную статистику, оценку достоверности с использованием критерия Стьюдента. В исследовании применялся метод k-средних кластерного анализа, который позволяет произвести разбиение множества исследуемых объектов и признаков на однородные в соответствующем понимании группы или кластеры. Большое достоинство кластерного анализа в том, что он позволяет производить разбиение объектов не по одному параметру, а по целому набору признаков [6]. Критическая величина уровня значимости принята равной 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Сравнительный анализ данных определения уровня окислительно-восстановительных ферментов и доли лимфоцитов с нарушенным мембранным потенциалом представлен в таблице 2.
Таблица 2
Показатели доли лимфоцитов со сниженным МПМ и активности ферментов лимфоцитов периферической крови у детей с ХНЗЛ в ремиссии (M±m)
|
Показатели |
ХНЗЛ (n=77) |
Контроль (n=23) |
р |
|
СДГ, гр./кл. |
18,51±0,77** |
23,42±0,58 |
<0,001 |
|
α-ГФДГ, гр./кл. |
10,82±1,12 |
12,85±0,82 |
>0,05 |
|
ЛДГ, гр./кл. |
17,69±1,78* |
11,75±0,96 |
<0,05 |
|
СДГ/α-ГФДГ |
1,63±0,25 |
1,80±0,7 |
>0,05 |
|
СДГ/ЛДГ |
0,91±0,08** |
1,98±0,06 |
<0,001 |
|
ЛДГ/α-ГФДГ |
1,62±0,29* |
0,91±0,03 |
<0,05 |
|
СДГ V |
34,47±2,39** |
22,89±1,63 |
<0,001 |
|
α-ГФДГ V |
35,21±3,84** |
20,71±1,29 |
<0,001 |
|
ЛДГ V |
27,29±1,98 |
26,36±2,96 |
>0,05 |
|
МПМ, % |
52,55±2,15** |
31,19±2,08 |
<0,001 |
Примечание: * – р<0,05, ** – р<0,001 – уровень статистической значимости различий значений показателей между группами.
Исследование цитоэнзиматического статуса лимфоцитов периферической крови свидетельствует о снижении клеточного энергообеспечения у детей с ХНЗЛ. В сравнении с группой «контроль» у них выявлено снижение в 1,3 раза уровня активности СДГ (p<0,001) и отношения СДГ/ЛДГ (p<0,001) и ЛДГ/α-ГФДГ (p<0,05), что указывает на несоответствие между энергопотребностью клетки и энергопродукцией в системе митохондриального окислительного фосфорилирования. Кроме того, обнаружено достоверное увеличение разнородности лимфоцитов по активности СДГ и α-ГФДГ (коэффициент V составлял, соответственно, 34,47±2,39 и 35,21±3,84), что характерно для гипоксических состояний [3].
При оценке уровня МПМ было выявлено, что у детей с ХНЗЛ показатель процентного содержания лимфоцитов со сниженным МПМ был в 1,7 раза выше, чем в группе контроля (p<0,001), что, в свою очередь, свидетельствовало об активации митохондриального пути апоптоза [16].
Для оценки диагностической ценности исследования МПМ у детей с ХНЗЛ использовался кластерный анализ, в процессе которого обследованные дети были разделены на 3 группы (кластера) (табл. 3).
Таблица 3
Средние значения доли лимфоцитов со сниженным МПМ и активности ферментов лимфоцитов периферической крови у детей с ХНЗЛ в каждом кластере (M±m)
|
Показатели |
1-й кластер (n=19) |
2-й кластер (n=17) |
3-й кластер (n=41) |
|
СДГ, гр./кл. |
24,02±0,75* |
18,65±0,83* |
13,3±0,69* |
|
СДГ V |
31,48±4,93 |
25,42±4,2 |
28,77±4,62 |
|
α-ГФДГ, гр./кл. |
10,22±1,31 |
15,01±2,09 |
9,66±1,51 |
|
α-ГФДГ V |
28,57±5,21 |
25,38±2,75 |
35,42±6,33 |
|
ЛДГ, гр./кл. |
20,78±2,06 |
19,01±0,53 |
15,92±1,79 |
|
ЛДГ V |
29,36±4,49 |
26,05±1,33 |
24,91±0,89 |
|
МПМ, % |
33,98±0,41* |
51,06±1,69* |
73,72±4,45* |
Примечание: * – достоверность различий между группами (р<0,001).
Как видно из представленных данных, группы достоверно различались по активности основного фермента цикла Кребса – СДГ, и процентному содержанию лимфоцитов со сниженным МПМ.
В 1-й кластер организовались дети, показатели которых были близки к нормативным показателям. Течение заболевания у детей этой группы характеризовалось отсутствием в 75% случаев обострений, средний возраст детей, объединившихся в данном кластере, составил 3,35±1,23 лет.
Во 2-ом кластере объединились дети, у которых, в сравнении с показателями 1-го кластера, активность СДГ была снижена в 1,3 раза (p<0,001) и в 1,5 раза увеличено процентное содержание лимфоцитов со сниженным МПМ. Активность α-ГФДГ имела тенденцию к увеличению, возможно, как компенсаторное повышение на снижение активности СДГ. О недостаточно полном характере компенсаторной реакции у детей этой группы свидетельствует достоверно высокое процентное содержание лимфоцитов со сниженным МПМ, поэтому изменения в состоянии здоровья, в том числе заболевания, сопровождающиеся дополнительной нагрузкой на уже возбужденную систему, могут в дальнейшем привести к снижению ее функциональной активности. Поэтому течение заболевания у детей этой группы характеризовалось увеличением числа пациентов, у которых обострения наблюдались 1-3 раз год (55%), при отсутствии обострений у 45% детей. Средний возраст детей, объединившихся в данном кластере, составил 4,8±2,54 лет.
Наиболее неблагоприятными по клинической характеристике являются наблюдения (53,2%), вошедшие в 3-й кластер, показатели которого характеризовались низкой активностью СДГ и высоким уровнем лимфоцитов, имеющих митохондрии со сниженным мембранным потенциалом. В этой группе было наибольшее число детей (68%), переносящих обострения заболевания 3-5 раз в год. Средний возраст детей, объединившихся в данном кластере, составил 8,72±1,9 лет (различия с показателем 1-го кластера p<0,05).
Таким образом, у 53,2% детей с ХНЗЛ даже в периоде ремиссии выявляются признаки митохондриальной недостаточности, зависящие от длительности заболевания.
Показатели СДГ и МПМ детей с ХНЗЛ, объединившихся в 1-ом кластере, можно принять за нормативные показатели, не требующие энерготропного пособия. Показатели СДГ и МПМ детей с ХНЗЛ, вошедших во 2-ой кластер, отражают возможности адаптации клеточных мембран без гибели клетки и требующие использования метаболической коррекции при сопутствующих простудных заболеваниях, других состояниях с повышенной физической или эмоциональной нагрузкой.
Показатели СДГ и МПМ 3-го кластера можно использовать как критерий энергодефицитного состояния у ребенка с ХНЗЛ, требующего метаболической коррекции.
В дополнение следует отметить, что предлагаемые методы оценки дизэнергетических состояний могут быть полезны при проведении динамических наблюдений и подборе энерготропной терапии при болезнях и синдромах, этиопатогенетически ассоциированных с митохондриальной недостаточностью.
