Введение. Африканская чума свиней (АЧС) – это контагиозная вирусная болезнь, поражающая домашних свиней и диких кабанов всех пород и возрастов. Это ДНК содержащий вирус, относящийся к семейству Asfiviridaeи роду Asfivirus [13, 16].
Летальность у восприимчивых животных достигает 100% (высокая степень патогенности) [21]. Это заболевание оказывает разрушительные последствия для мировой свиноводческой отрасли, поскольку влечет за собой огромные экономические потери, складывающиеся из затрат на проведение карантинных и ветеринарно – санитарных мероприятий (убой всего поголовья) на территории очага болезни [1].
Вирус АЧС является катастрофой для любой страны. Поскольку в настоящее время вирус АЧС продолжает распространяться и регистрироваться в новых европейских, азиатских странах являющихся ранее благополучными. Циркуляция вируса АЧС среди домашних свиней, а также попадание вируса в дикую природу к кабанам усложняет ликвидацию заболевания [6, 12].
На сегодняшний день до сих пор не разработана безопасная и эффективная коммерческая вакцина против АЧС [7, 10, 20]. Вирус АЧС обладает большой эволюционной скоростью изменчивости (3,31 × 10−4 замен/позиция/год с экспоненциальным ростом 0,01 в год-1) по сравнению с другими крупными ДНК содержащими вирусами АЧС [3]. Изоляты вируса АЧС различаются по своим биологическим свойствам, поэтомувопрос их группирования и классификации, а также генотипирования и сероиммунотиповой идентификации является главенствующим [2, 4, 5].
Генетическую вариабельность вируса АЧС изучают методом секвенирования определенных фрагментов геномов или проведение полногеномного и сравнения их с известными изолятами и штаммами.
Цель исследования – провести филогенетический анализ отечественных изолятов вируса африканской чумы свиней по гену B602L.
Условия, материалы и методы. Исследования проводились на базе ФГБНУ «Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии». Объектами исследования являлись 60 отечественных изолятов вируса АЧС выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг. Во всех исследованных образцах было показано наличие генома вируса АЧС при исследовании методом ПЦР в режиме реального времени.
Выделение ДНК осуществляли набором «Рибо-сорб» (Интерлабсервис, Россия), согласно инструкции производителя.Реакцию ПЦР проводили в амплификаторе «MaxyGeneGradient», (США). Температурный режим и количество циклов для прибора «СFX96Touch» составлял: 3 мин денатурации при температуре 94°C; отжиг праймеров при 53°C –30 сек, элонгация при 72°C – 45 сек. (40 циклов).
Анализ ДНК осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле, содержащем 0,001% интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили при силе тока 50 мА и напряжении 150 В в течение 40 минут. ДНК визуализировали на гель-документирующей системе «ChemiDoc MP» («Bio-RadLaboratories», США) в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.Очистка полученных из геля ПЦР-продуктов осуществлялась с применением набора “Cleanup - standard” (Евроген, Россия). Набором Bigdyeterminator v3.1 (Applied Biosystems, США) проводилась сиквенсовая реакция в соответствии с инструкцией производителя. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена B602L, вируса АЧС проводили с использованием специфических для определѐнного фрагмента генома праймеров:
ORF9L-F1 (5'AATGCGCTCAGGATCTGTTAAATCGG3');
ORF9L-R2 (5'TCTTCATGCTCAAAGTGCGTATACCT3') [9].
Далее полученные нуклеотидные последовательности фрагментов гена вируса АЧС собирали и выравнивали с использованием компьютерной программы «BioEdit v.7» [15]. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями гена вируса АЧС взятых из базы данных «GenBank» с использованием программы «BLASTN» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[8].
Для построения дендрограммы применяли метод «Bootstrap» (максимального правдоподобия) с анализом 1000 случайных выборок, с использованием программы «Mega 7.0» [17].
Результаты и обсуждения. Наиболее известным и информативным маркером для изучения генетического разнообразия между отечественными изолятами и штаммами вируса АЧС считается ген B602L. Он часто используется в молекулярно-генетических исследованиях. Этот маркерный генпозволяет более точно выявлять филогенетические взаимоотношения между штаммамивируса АЧС.
Ген B602L (CVR) располагается в центральной вариабельной области генома. Является наиболее вариабельным участком генома и содержит повторы длиной 12 п.н. В гене B602L локализовано большое количество повторяющихся аминокислотных тетрамеров они варьируются по количеству и составу у различных штаммов и изолятов вируса АЧС [14, 22].
В настоящее время известно, что все исследованные отечественные изоляты выделенные на территории Российской Федерации имеют только один из вариантов центральной вариабельной области гена B602L(CVR1) [19].
Следует отметить, что у эстонских изолятов второго генотипа выделенных в популяции дикого кабана, были обнаружены два генетических варианта (CVR-1 и CVR-2), содержащих семь и десять тетрамеров [18].
До сих пор неизвестны причины вариабельности гена B602L однако имеются данные о том, что белок pB602L кодируемый таким же геном принимает участие в корректировке правильности формирования вторичных и третичных структур капсидного белка p72 и является неструктурным белком, который исключен из процесса репликации вируса АЧС [22].
Этот ген, как и многие другие, позволяет выявить изменения среди изолятов вируса АЧС. Поэтому для определения филогенетического родства отечественных изолятов выделенных на территории Российской Федерации с 2016 по 2017 гг. нами была определена нуклеотидная последовательность этого гена.
С целью определения филогенетических отношений изолятов и штаммов вируса, отечественных изолятов вируса АЧС выделенных в 2016 по 2017 гг. и данных взятых из «GenBank» был проведен филогенетический анализ на основе нуклеотидных последовательностей гена B602L с использованием статистического метода «максимального правдоподобия». (рис. 1). Анализ изолятов вируса АЧС проводился программой «MEGA v.5.2». Построенная дендрограмма отражает филогенетические отношения штаммов и изолятов из стран Европы и Азии, представляющие II генотип вируса (табл. 1).
Таблица 1 – Изоляты вируса АЧС из стран Европы и Азии, взятые из генбанка и использованные при построении филогенетического древа по гену B602L
|
Код штамма вируса |
Страна |
Выделен от |
Год |
Генотип |
Код последовательности в Генбанк |
|
Georgia 2007/1 |
Грузия |
Дикий кабан |
2007 |
II |
FR682468.2 |
|
Belgium/Estalle /wb/2018 |
Бельгия |
Свиньи |
2019 |
II |
MK543947 |
|
Belgium 2018/1 |
Бельгия |
Свиньи |
2019 |
II |
LR536725 |
|
Estonia 2014 |
Эстония |
Свиньи |
2014 |
II |
LS478113 |
|
Wuhan 2019-2 |
Китай |
Свиньи |
2019 |
II |
MN393477 |
|
China/2018/AnhuiXGO |
Китай |
Свиньи |
2018 |
II |
MK128995 |
|
Pig/HlJ/2018 |
Китай |
Свиньи |
2018 |
II |
MK333180 |
Также для сравнения изолятов нами был выбран референс – штамм референс-штаммом «Georgia 2007/1» (FR682468.2), который впервые был обнаружен в 2007 году.
Согласно филогенетическому анализу по гену B602L все исследованные изоляты и штаммы вируса АЧС по степени гомологии разделились на два кластера. Так, сорок восемь изолятов отечественного происхождения были сгруппированы в один кластер с изолятами и штаммами из стран Европы и Азии. Анализ нуклеотидных последовательностей этих изолятов показал высокую консервативность (100 % гомология).
Рисунок 1 – Филогенетическое древо, построенное по методу «Bootstrap (максимального правдоподобия)» на основании данных нуклеотидных последовательностей B602Lизолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ с 2016 г. по 2019 г.
Во втором кластере представлены двенадцать отечественных изолятов, их группообразование произошло благодаря имеющимся идентичным единичным заменам в нуклеотидной последовательности.
Выводы. Таким образом, согласно проведенному филогенетическому анализу по гену B602L удалось установить, что выделенные на территории Российской Федерации отечественные изоляты с 2016 по 2017 года оказались идентичными (100% гомология) и принадлежат ко второму генотипу.В дальнейшем обнаружение большого количества новых изолятов с генетическими мутациями в нуклеотидных последовательностях по гену B602L позволит провести их дифференциацию.
Работа выполнена при поддержки гранта Президента РФ МК-2000.2017.11 от 22.02.17.
