Введение. Успех селекции в значительной степени зависит от точности определения племенной ценности животных. В связи с этим ценность методов, помогающих выявить лучших животных и предсказать их племенные качества в раннем возрасте возрастает. Достижения современной молекулярной генетики позволяют определить гены, которые контролируют экономические признаки. В дополнение к традиционному отбору животных, выявление вариантов генов позволит проводить селекцию непосредственно на уровне ДНК [1].
Ген OLR1 обнаруженный в 30-UTR связан с составом молока в различных популяциях молочного скота. В молочном скотоводстве коровы с генотипом СС имели более высокие показатели по молочному жиру, массовой доле жира в молоке, чем у аналогов генотипа АА [2, 3]. Ген OLR1 также влияет на количество отложений жира в туше и «мраморность» говядины [4].
При исследовании генотипов гена OLR1 при одной базовой мутации у крупного рогатого скота в Иране было обнаружено, что частота встречаемости генотипов были почти одинаковыми для генотипов AA, AC и CC, а именно 0,22, 0,50 и 0,28 соответственно; в то время как частота встречаемости аллелей A и C были 0,47 и 0,53 соответственно, средние значения продуктивности животных с генотипами OLR1 составили 8273 кг (CC), 8344 кг (AC) и 7178 кг (AA) по удою; 276,3 кг (CC), 277,6 кг (AC) и 239,7 кг (AA) по выходу молочного жира и белка, 286,7 кг (CC), 290,5 кг (AC) и 253 кг (AA), (АС) и 253 кг (АА) (P<0,05) [5]. Почти аналогичная частота для аллелей А и С были также зарегистрирована у крупного рогатого скота в США, а именно 0,46 и 0,54 [6], и у крупного рогатого скота в Польше, а именно 0,43 и 0,57 [7]. В другом исследование на том же базовом маркере g.8232CNA в не трансляционной области 3' UTR гена OLR1 у красно-белой породы польского скота определена частота генотипов с наибольшей последовательностью для CC (0,53), AC (0,34) и AA (0,13) [8]. Коровы с генотипом CC имели самый высокий процент жира в молоке, в тоже время с генотипом AA – самый низкий, а генотип AC – промежуточный (P<0,05) [9].
Полиморфизм DGAT1 A232K как было показано ранее, оказывает значительное влияние на показатели молочной продуктивности (выход молока, содержание белка и жира, жирнокислотный состав). При изучении частот встречаемости аллелей была выявлена значительная степень разнообразия в зависимости от рассматриваемой популяции, что вызвано разными целями разведения, относительно состава молока у разных пород и в разных странах. Достоверное снижение содержания белка в молоке и удоя, увеличение содержания жира в молоке было связано с заменой на лизин (К-аллель). Вариант с заменой на аланин (А-аллель) был связан с увеличением содержания белка в молоке и удоя, но снижением количества жира в молоке [10].
Генотипирование K232A в гене DGAT1 выявило чёткое географическое распределение частот генотипов. Частоты аллелей К и А составляют 0,1667 и 0,8333, соответственно, что указывает на то, что частота аллеля А у голштинского скота значительно выше, чем у китайского скота. Также существует значительная корреляция между полиморфизмом генотипов KK, KA и AA гена DGAT1 с массовой долей жира в молоке. Аллель А в основном фиксируется у северного китайского скота (Bos taurius), в то время как аллель K доминирует у южно-китайского скота (Bos indicus), предопределяя то, что северная группа крупного рогатого скота имеет более низкое содержание молочного жира, чем у южной группы крупного рогатого скота [11].
При изучении аллельного полиморфизма гена DGAT1 у местного иракского скота выявлено, что частоты генотипов KK, KA и AA составили 0,40, 0,30 и 0,30, соответственно. Частота аллелей K и A составила 0,60 и 0,40, соответственно. Генотип KK был значительно (P<0,05) связан с более высоким показателем количества молочного жира. Таким образом, ген DGAT1 может служить генетическим маркером для селекции на показатель жира в молоке у коров [12].
Исследования показали, что ген DGAT1 влияет на удой и состав молока у итальянских голштинов [13], белых пород крупного рогатого скота фулани и боргу [14], симментальской и бурой швейцарской пород крупного рогатого скота в Хорватии [15].
В экзоне 8 полиморфизм обнаружено не было. Таким образом, позиция K232A была признана консервативной и скрепленным регионом для высокого содержания молочного жира (аллель K) у Bos indicus и всех пород буйволов [16].
При изучении генетических изменений в гене лептина у пород крупного рогатого скота (восточно-анатолийская красная и анатолийская черная), частоты аллелей Т и С составили 0,54 и 0,46 для восточно-анатолийского красного скота, 0,48 и 0,52 для анатолийского черного, соответственно. Результаты статистического анализа показали, что встречаемость генотипа ТТ у анатолийской черной породы был выше, чем других генотипов CC и CT (Р<0,05). Эти результаты показывают, что генотип лептина TT связан с увеличением окружности грудной клетки. Эти сведения могут представлять экономический интерес [17].
При изучении полиморфизма гена лептина полиморфизма экзона 3 (локус A59V) и интрона 2 (локус SAU3AI) в находящейся под угрозой исчезновения популяции автохтонного скота был обнаружен один генотип A59V (CC), и два SAU3AI генотипа, AA и AB, с частотой 78,26 % и 21,74 %, соответственно [18].
Среди коров голштинской породы Республики Татарстан частота встречаемости аллелей C и T у изучаемого гена составила: 0,570 и 0,430 соответственно. Наблюдаемое распределение генотипов было следующим: TT – 18,4 %; TC – 49,1 %; CC – 32,5 %, что говорит о полиморфной популяции. Полученные данные указывают на разнообразие генетической структуры голштинской популяции крупного рогатого скота Республики Татарстан. Изучая ассоциации гена лептина с динамикой молочной продуктивности за три лактации коров голштинской породы выявлено, что наилучшие показатели по всем трем лактациям были выявлены в группе животных с генотипом TT гена LEP [19].
После проведения ДНК-исследования скота японского черного скота определены частоты аллелей гена LEP C и T в соотношении 0,71 и 0,29, соответственно [20].
По данным исследований на голштинском скоте Татарстана распределение частот аллелей С (А) и Т (В) гена LEP было следующим: С - 0,41-0,62 и Т - 0,38-0,59 [21, 22].
В связи с вышесказанным нами поставлена цель – изучить аллельный полиморфизм генов липидного обмена (OLR1, DGAT1 и LEP) у коров холмогорской породы татарстанского типа.
Условия, материалы и методы. Исследования проводились в СХПК «Агрофирма Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан.
Предметом исследования были пробы цельной крови, отобранные для исследования от 79 коров холмогорской породы татарстанского типа.
В исследовании поголовье первотёлок было представлено только двумя ведущими генеалогическими линиями голштинской породы, а именно: Вис Айдиала 933122 и Рефлекшн Соверинга 198998.
ДНК из исследуемых проб крови выделяли при помощи коммерческого набора «Рибо-преп» (производитель ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), согласно утверждённой производителем инструкции к набору.
Генотипирование коров по генам OLR1, DGAT1 и LEP выполнили методом ПЦР-ПДРФ и АС-ПЦР с использованием ДНК-амплификатор DNA Engine РТС (США). Для амплификации специфичного фрагмента гена OLR1 длиной 143 bp применяли праймеры OLR1-F: 5/-TCCCTAACTTGTTCCAAGTCCT-3/ и OLR1-R: 5/-CTCTACAATGCCTAGAAGAAAGC-3/. При проведении ПДРФ-анализа OLR1-гена 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 20 ед. эндонуклеазы рестрикции PstI в 1×буфере «O» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С в течение ночи.
Для амплификации специфичного фрагмента гена DGAT1 длиной 100 bp применяли праймеры DGAT1-1: 5/-ccgcttgctcgtagctttcgaaggta acgc-3/, DGAT1-2: 5/-ccgcttgctcgtagctttggcaggtaacaa-3/, DGAT1-3: 5/-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3/ [23]. Для проведения ПДРФ-анализа DGAT1-гена 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 20 ед. эндонуклеазы рестрикции TaqI в 1×буфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 65 0С в течение ночи.
Для амплификации аллель-специфичных фрагментов гена LEP длиной 239 bp, 164 bp и/или 131 bp применяли праймеры LEP-F1: 5/-GACGATGTGCCACGTGTGGTTTCTTCTGT-3/, LEP-R1: 5/-CGGTTCTACCT CGTCTCCCAGTCCCTCC-3/, LEP-F2: 5/-TGTCTTACGTGGAGGCTGTGCCC AGCT-3/, LEP-R2: 5/-AGGGTTTTGGTGTCATCCTGGACCTTTCG-3/ [24].
Анализ результатов цельных фрагментов, ПЦР-ПДРФ- и АС-продуктов выполняли с использованием комплекта реагентов для проведения гель-электрофореза, производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Фиксирование результатов выполняли гель-документирующей системой GelDoc X+ (Bio-Rad).
По результатам генотипирования крупного рогатого скота рассчитали частоту встречаемости аллелей и генотипов по генам OLR1, DGAT1 и LEP.
Частоту встречаемости аллелей и генотипов, наблюдаемую и ожидаемую частоты генотипов, хи-квадрат в популяции рассчитывали по общепринятым формулам, используемым в ветеринарной генетике с основами вариационной статистики.
Результаты и обсуждение. Изучение генетической структуры отдельной популяции сельскохозяйственных животных позволяет сохранить ценный генофонд и выбрать наиболее эффективные методы селекции. Установлено, что в изучаемом стаде скота 49,4 % животных несли генотип OLR1 гена CC, тогда как генотипы OLR1 AC и OLR1 AA составили 46,8 % и 3,8 %, соответственно. Частота аллелей OLR1 A и OLR1 C по стаду составила 0,27 и 0,73, соответственно (табл. 1).
Таблица 1 - Полиморфизм гена рецептора липопротеина низкой плотности (OLR1) у коров
|
Показатель |
n |
Частота генотипа |
Частота аллеля |
χ2 |
||||||
|
АА |
АС |
СС |
||||||||
|
n |
% |
n |
% |
n |
% |
А |
С |
|||
|
О |
79 |
3 |
3,8 |
37 |
46,8 |
39 |
49,4 |
0,27 |
0,73 |
2,88 |
|
Е |
6 |
7,6 |
31 |
39,2 |
42 |
51,2 |
||||
Примечание: О – фактически наблюдаемый показатель, Е – теоретически ожидаемый показатель
Также исследования по гену OLR1 показали, что чаще встречаются коровы с генотипами OLR1 CC линии Р. Соверинга (63,0 %) и OLR1 AC линии Айдиала (51,9 %). Частота встречаемости аллелей OLR1 A и OLR1 C в стаде по линиям голштинской породы (В. Айдиал, Р. Соверинг) была в пределах 0,19-0,32 и 0,68-0,81, соответственно.
У первотёлок с разными генотипами по гену DGAT1 наиболее часто встречаются коровы с гомозиготным генотипом DGAT1 AA (57,0 %). Животных с генотипом DGAT1 AK – 40,5 %, наименьшее количество выявлено с генотипом DGAT1 KK (2,5 %). Наибольшей встречаемостью обладал аллель DGAT1 A (0,77), который преобладал над аллелем DGAT1 K (0,23) (табл. 2).
Таблица 2 - Полиморфизм гена диацилглицерол-О-ацилтрансферазы (DGAT1) у коров
|
Показатель |
n |
Частота генотипа |
Частота аллеля |
χ2 |
||||||
|
AA |
AK |
KK |
||||||||
|
n |
% |
n |
% |
n |
% |
А |
K |
|||
|
О |
79 |
45 |
57,0 |
32 |
40,5 |
2 |
2,5 |
0,77 |
0,23 |
1,66 |
|
Е |
47 |
59,5 |
28 |
35,4 |
4 |
5,1 |
||||
Примечание: О – фактически наблюдаемый показатель, Е – теоретически ожидаемый показатель
По результатам исследований первотёлок с разными генотипами гена DGAT1 установлено преобладание генотипа DGAT1 AA, частота встречаемости составила 66,7 % по линии Р. Соверинга и 51,9 % по линии В. Айдиала. Частота аллеля A гена DGAT1 (0,74-0,83) у животных с разными генеалогическими линиями по голштинской породе выше, чем аллеля K гена DGAT1 (0,17-0,26).
Анализ полиморфизма гена LEP позволил выявить, что наибольшая встречаемость у коров по гетерозиготному генотипу LEP CT (57,0 %). По гомозиготным генотипам LEP CC и LEP TT частота встречаемости ниже и составила 30,4 % и 12,6 %, соответственно. Различия по частоте встречаемости аллелей LEP C и LEP T по стаду составили 0,59 и 0,41, соответственно (табл. 3).
По распределению частот генотипов у первотёлок в зависимости от линейной принадлежности к голштинской породе установлено схожее соотношение. Наибольшая встречаемость генотипов LEP CT линии В. Айдиала (57,7 %) и линии Р. Соверинга (55,7 %). Частота встречаемости аллелей LEP C и LEP T в популяции с разными линиями голштинской породы находилась в пределах 0,57-0,60 и 0,40-0,43, соответственно.
Таблица 3 - Полиморфизм гена лептина у коров (LEP)
|
Показатель |
n |
Частота генотипа |
Частота аллеля |
χ2 |
||||||
|
CC |
CT |
TT |
||||||||
|
n |
% |
n |
% |
n |
% |
C |
T |
|||
|
О |
79 |
24 |
30,4 |
45 |
57,0 |
10 |
12,6 |
0,59 |
0,41 |
2,55 |
|
Е |
28 |
35,4 |
38 |
48,1 |
13 |
16,5 |
||||
Примечание: О – фактически наблюдаемый показатель, Е – теоретически ожидаемый показатель
Схожие результаты по полиморфизму генов липидного обмена (OLR1, DGAT1 и LEP), в т.ч. в разрезе линейной принадлежности к голштинской породе получены в наших ранних исследованиях, проведённых на быках-производителях чёрно-пёстрой породы: по генам рецептора липопротеина низкой плотности [25], диацилглицеро-О-ацилтрасферазы и лептина [26].
Вывод. В стаде коров преобладали аллель C (0,73) и генотип СС 49,4 % гена OLR1; аллель А (0,77) и генотип АА 57,0 % гена DGAT1; аллель C (0,59) и генотип СТ 57,0 % гена LEP. В изучаемой выборке генетическое равновесие не смещено ни по одному исследуемому гену. У первотелок частота встречаемости аллелей генов OLR1, DGAT1 и LEP в зависимости от линейной принадлежности (В. Айдиал и Р. Соверинг) примерно одинаковая. Получены схожие данные, что с учётом принадлежности к голштинской породе наибольшая встречаемость аллелей у первотёлок: C (0,68-0,81) по гену OLR1, А (0,74-0,83) по гену DGAT1 и C (0,57-0,60) по гену LEP, соответственно.
