Многие современные исследования затрагивают вопрос о том, насколько важна регуляция численности вредных насекомых при современном интенсивном земледелии [1,2]. В настоящий момент широко распространена борьба с вредителями посредством химических инсектицидных средств, являющихся токсичными веществами, загрязняющими окружающую среду [3]. Для снижения применения химических агентов защиты растений от вредителей ведется поиск альтернативных средств [4,5].
Такие насекомые как пшеничный трипс (Haplothrips tritici) и полосатая хлебная блошка (Phyllotreta vittula) являются одними из наиболее распространенных вредителей яровой пшеницы и наносят значительный ущерб ее урожаю [6,7]. Данные вредители несколько различны по строению ротового аппарата, а, следовательно, по способам питания, из-за чего, оказывают различное влияние на организм растений. Пшеничный трипс имеет колюще-сосущий ротовой аппарат, во взрослом состоянии питается клеточным соком листьев и колосковых чешуй растений, снижая, таким образом, эффективность их фотосинтеза [8]. В свою очередь, личинки трипса, поражают колоски и, питаясь зерновками, снижают качество зерна напрямую [9]. Полосатая хлебная блошка имеет грызущий ротовой аппарат, взрослые особи соскабливают мякоть с поверхности листьев. Поскольку появляются имаго полосатой блошки достаточно рано, они сильно вредят растениям в стадию всходов – в то время, когда в растении закладываются все основные процессы развития его организма [10].
Благодаря совместной эволюции микроорганизмов, растений и насекомых-вредителей, представители всех групп успешно приспособились к совместному существованию [11,12]. Любой элемент системы растение-фитофаг-микробиом оказывает свое влияние на все остальные элементы системы [13]. Показано, что микробиом растений напрямую влияет на микробиом насекомых, поедающих эти растения, и, в свою очередь, микробиом, в организме вредных насекомых оказывает влияние на снижение естественного иммунитета растений к этим вредителям [14].
Кроме того, показано, что микрофлора кишечника насекомых влияет на их устойчивость к стрессовым факторам. В особенности, такой устойчивости способствуют представители рода Pantoea, которые часто встречаются в кишечнике фитофагов, в том числе блошек и трипсов [15,16,17]. Есть исследования, которые показывают, что изменение соотношения микробионтов кишечника насекомых в сторону преобладания представителей рода Bacillus снижают устойчивость насекомых к болезням и действию химических инсектецидов [18]. Таким образом, есть большая вероятность того, что использование биологических препаратов, основанных на живых бактериях, способных изменять микрофлору организма вредных насекомых может положительно повлиять на их сдерживание [19].
Учитывая все сказанное выше, можно прийти к выводам о том, что изучение микробиома вредных насекомых и его изменение при помощи биологических препаратов может способствовать регуляции их численности и вредоносности, а применение таких препаратов на растениях может способствовать повышению устойчивости последних к вредителям.
Целью данных исследований являлось изучение кишечной микрофлоры пшеничного трипса и полосатой хлебной блошки, обитающих на растениях яровой пшеницы, при ее обработке биологическими препаратами на основе бактерий Bacillus mojavensis PS17 и Bacillus amyloliquefaciens RECB-95.
Условия, материалы и методы.
Мягкая яровая пшеница сорта Ульяновская-105 возделывалась в течение трех вегетационных сезонов с 2020 по 2022 гг. в Лаишевском районе республики Татарстан. Пшеница возделывалась в серой лесной почве со следующим агрохимическими показателями: исходное содержание гумуса 3,2% (по Тюрину), подвижного фосфора и калия (по Кирсанову) – 233-240 мг/кг почвы, и 176-189 мг/кг почвы рН сол. – 5,7. Три сезона возделывания отличались между собой по погодным условиям. Период вегетации в 2020 году был достаточно влажным и прохладным. Период вегетации в 2021 году был жарким и экстремально засушливым. В период вегетации 2022 года в начале развития растений наблюдалась умеренная влажность и комфортные температуры воздуха, но в конце вегетационного сезона периодически наблюдались засушливые явления с жаркими температурами.
В качестве средств защиты на растениях применялись биологические препараты на основе бактерий в различных нормах применения, а также для сравнения в отдельном варианте использовались химические средства защиты. Схема стационарного полевого опыта предусматривала изучение следующих вариантов: контроль (без обработки); обработка семян PS17 0,5 л/т + опрыскивание растений PS17 0,5 л/га; обработка семян PS17 1,0 л/т + опрыскивание растений PS17 1,0 л/га; обработка семян PS17 дозой 1,5 л/т + опрыскивание растений PS17 1,5 л/га; обработка семян RECB-95 1,0 л/т + опрыскивание растений RECB-95 1,0 л/га; обработка семян и опрыскивание растений химическими фунгицидами. Химическая обработка заключалась в протравливании семян перед посевом фунгицидом «Ламадор» (протиоконазол, тебуконазол) дозой 0,15 л/т и опрыскивание растений препаратом «Пропишанс» (пропиконазол) дозой 0,5 л/га. Химическая обработка проводилась только в два сезона возделывания: 2021-2022 гг., и не проводилась в сезон 2020 года, в то время как все остальные варианты обработки, а так же необработанный контрольный вариант присутствовали на протяжении всех рассматриваемых сезонов.
Штаммы Bacillus mojavensis PS17 и Bacillus amyloliquefaciens RECB-95 являются факультативными эндофитами сельскохозяйственных культур. Штамм PS17 был выделен из семян пшеницы, штамм RECB-95 – из стеблей и корней томатов.
Учет и сбор для анализа особей полосатой хлебной блошки производился на стадиях всходов и выхода в трубку. Отлов особей производился при помощи ловушек [20]. Отбор и учет особей пшеничного трипса производился в стадии выхода в трубку, колошения и цветения [21]. Насекомых в лаборатории измеряли, перед посевом на питательную среду поверхностно стерилизовали при помощи этилового спирта и высевали на питательный агар целиком, или готовили гомогенат из их тел [22]. При посеве на питательные среды гомогената готовили последовательные разведения.
Материал высевали на чашки с питательным агаром: Lysogeni Broth (LB) [23, 24] и мясо-пептонный агар (МПА). Чашки с материалом инкубировали в течение 2 суток при температуре 28°С. Затем, проводили морфологический анализ полученных колоний микроорганизмов и их количественный учет. Подсчет количества (КОЕ) микроорганизмов производили согласно стандартным методикам [25], при статистической обработке использовали стандартное отклонение.
Для видовой идентификации выделенных микроорганизмов проводили ПЦР участка гена 16S рРНК [26, 27] с последующим секвенированием по Сэнгеру.
Результаты и обсуждения.
В ходе изучения кишечной микрофлоры вредителей были получены данные по общему количеству микроорганизмов в кишечниках этих насекомых, а также, видовой состав этих микроорганизмов.
Общее количество микроорганизмов в кишечнике полосатой хлебной блошки приведено в таблице 1.
Таблица 1 – Количество микроорганизмов в кишечнике полосатой хлебной блошки в зависимости от обработки растений пшеницы биологическими препаратами и химическими фунгицидами в 2020-2022 гг.
|
Вариант |
2020 г., КОЕ×104/100 мг материала |
2021 г., КОЕ×104/100 мг материала |
2022 г., КОЕ×104/100 мг материала |
|
Контроль (без обработки) |
18,40±0,30 |
14,50±0,80 |
18,15±0,17 |
|
Обработка семян PS 17 0,5 л/т + опрыскивание растений PS 17 0,5 л/га |
4,10±0,30 |
5,40±0,10 |
1,40±0,19 |
|
Обработка семян PS 17 1,0 л/т + опрыскивание растений PS 17 1,0 л/га |
0,10±0,04 |
0,20±0,05 |
0,20±0,05 |
|
Обработка семян PS 17 1,5 л/т + опрыскивание растений PS 17 1,5 л/га |
1,00±0,02 |
1,20±0,04 |
1,35±0,04
|
|
Обработка семян RECB-95 1,0 л/т + опрыскивание растений RECB-95 1,0 л/га |
7,20±0,50 |
3,20±0,10 |
3,80±0,40 |
|
Хим. препараты («Ламадор 0,15 л/т + «Пропишанс» 0,5 л/га) |
-* |
не обнаружены |
4,00±0,50 |
|
НСР05 |
0,10 |
0,20 |
0,20 |
* вариант обработки не применялся в 2020 году
В кишечнике полосатой хлебной блошки наиболее обильная микрофлора отмечена в контрольном варианте, во всех обработанных вариантах количество микроорганизмов в кишечнике заметно снижено, в особенности это характерно для блошек, обитавших на растениях, обработанных химическим препаратом и PS 17 в норме 1,0 л/т.
В таблице 2 представлены данные по видовому составу микроорганизмов в кишечнике полосатой хлебной блошки.
Таблица 2 – Влияние обработки растений пшеницы биологическими препаратами и химическими фунгицидами на микроорганизмы в кишечнике полосатой хлебной блошки в 2020-2022 гг.
|
Вариант |
2020 г. |
2021 г. |
2022 г. |
|||
|
виды бактерий |
кол-во, КОЕ х104/100 мг материала |
виды бактерий |
кол-во, КОЕ х104/100 мг материала |
виды бактерий |
кол-во, КОЕ х104/100 мг материала |
|
|
Контроль (без обработки) |
Bacillus amyloliquefaciens |
0,74±0,22 |
Bacillus amyloliquefaciens |
0,58±0,02 |
Bacillus amyloliquefaciens |
0,72±0,04 |
|
Pantoea spp |
17,66±2,77 |
Pantoea spp |
13,92±0,45 |
Pantoea spp |
17,42±0,25 |
|
|
Обработка семян PS 17 0,5 л/т + опрыскивание растений PS 17 0,5 л/га
|
Bacillus amyloliquefaciens |
0,45±0,08 |
Bacillus amyloliquefaciens |
0,80±0,01 |
Bacillus amyloliquefaciens |
1,14±0,36 |
|
Bacillus toyonensis |
3,40±0,08 |
Bacillus toyonensis |
4,40±0,18 |
Bacillus toyonensis |
0,14±0,03 |
|
|
Pantoea spp |
0,25±0,08 |
Pantoea spp |
0,20±0,05 |
Pantoea spp |
0,12±0,05 |
|
|
Обработка семян PS 17 1,0 л/т + опрыскивание растений PS 17 1,0 л/га
|
Bacillus amyloliquefaciens |
0,08±0,01 |
Bacillus amyloliquefaciens |
0,17±0,02 |
Bacillus amyloliquefaciens |
0,17±0,04 |
|
Pseudomonas syringae |
<0,01 |
Pseudomonas syringae |
0,02±0,01 |
Pseudomonas syringae |
0,02±0,01 |
|
|
Pantoea spp |
<0,01 |
Pantoea spp |
0,01±0,01 |
Pantoea spp |
0,01±0,01 |
|
|
Обработка семян PS 17 1,5 л/т + опрыскивание растений PS 17 1,5 л/га
|
Bacillus amyloliquefaciens |
1,00±0,02 |
Bacillus amyloliquefaciens |
1,20±0,04 |
Bacillus amyloliquefaciens |
1,06±0,19 |
|
Pseudomonas syringae |
0,16±0,01 |
|||||
|
Pantoea spp |
0,13±0,01 |
|||||
|
Обработка семян RECB-95 1,0 л/т + опрыскивание растений RECB-95 1,0 л/га
|
Bacillus amyloliquefaciens |
3,50±0,18 |
Bacillus amyloliquefaciens |
1,60±0,01 |
Bacillus amyloliquefaciens |
3,53±0,13 |
|
Bacillus toyonensis |
3,70±0,21 |
Bacillus toyonensis |
1,60±0,01 |
Bacillus toyonensis |
0,27±0,04 |
|
|
Хим. препараты («Ламадор 0,15 л/т + «Пропишанс» 0,5 л/га) |
-* |
-* |
не обнаружены |
- |
Pantoea spp. |
3,96±0,22 |
* вариант обработки не применялся в 2020 году
Видовой состав кишечной микрофлоры полосатой хлебной блошки не слишком разнообразен, представлен двумя видами рода Bacillus, некоторыми представителями рода Pantoea, и редко – представителями рода Pseudomonas. Вид Pseudomonas syringae отмечается только в одном варианте – при обработке растений PS 17 в норме 1,0 л/га в сезоны 2021 и 2022 гг. Данный вид достаточно обычен для кишечной микрофлоры насекомых, но может являться патогенным для растений [28].
Можно отметить, что видовой состав микроорганизмов в кишечнике хлебной блошки не сильно отличается в разные сезоны, за исключением некоторых вариантов (обработка растений RECB-95), где в 2022 году видовой состав несколько более разнообразен, чем в предыдущие сезоны. Во все сезоны в контрольных вариантах отмечается один представитель рода Bacillus и один представитель рода Pantoea, последний из которых заметно преобладает над другим. При обработке пшеницы биопрепаратами данная картина меняется – становится больше видов рода Bacillus и их количество становится значительно больше, чем Pantoea spp, вплоть до исчезновения данного рода в вариантах обработки пшеницы RECB-95. Что касается насекомых, обитавших на растениях, обработанных химическим препаратом, то в их кишечнике наблюдается обратная картина – исчезают представители рода Bacillus и остается лишь несколько неопределенных видов рода Pantoea, при довольно низком общем количестве микроорганизмов.
В таблице 3 представлены данные по общему количеству микроорганизмов в кишечнике пшеничного трипса.
Таблица 3 – Общее количество микроорганизмов в кишечнике пшеничного трипса в зависимости от обработки растений пшеницы биологическими препаратами и химическими фунгицидами в 2020-2022 гг.
|
Вариант |
2020 г., КОЕ×104/100 мг материала |
2021 г., КОЕ×104/100 мг материала |
2022 г., КОЕ×104/100 мг материала |
|
Контроль (без обработки) |
1,80±0,17 |
2,00±0,04 |
2,03±0,17 |
|
Обработка семян PS 17 0,5 л/т + опрыскивание растений PS 17 0,5 л/га |
0,90±0,07 |
1,10±0,10 |
2,15±0,26 |
|
Обработка семян PS 17 1,0 л/т + опрыскивание растений PS 17 1,0 л/га |
2,50±0,22 |
0,80±0,04 |
0,67±0,04 |
|
Обработка семян PS 17 1,5 л/т + опрыскивание растений PS 17 1,5 л/га |
3,70±0,20 |
1,70±0,10 |
1,15±0,12 |
|
Обработка семян RECB-95 1,0 л/т + опрыскивание растений RECB-95 1,0 л/га |
5,00±0,34 |
6,10±0,10 |
1,00±0,09 |
|
Хим. препараты («Ламадор 0,15 л/т + «Пропишанс» 0,5 л/га) |
-* |
1,50±0,20 |
1,00±0,11 |
|
НСР05 |
0,20 |
0,30 |
0,30 |
* вариант обработки не применялся в 2020 году
В кишечнике пшеничных трипсов количество микроорганизмов заметно меньше, чем в кишечнике полосатых хлебных блошек, что может быть связано с характером их питания – потребление жидкой пищи через колюще-сосущий ротовой аппарат [29]. Наибольшее количество бактерий, в среднем, наблюдается в кишечнике трипсов, обитавших на растениях, обработанных RECB-95. В некоторых вариантах обработки, наблюдается изменение количества микроорганизмов в кишечнике трипсов в разные сезоны. Так, например, при обработке растений штаммом PS 17 в норме 1,0 л/т и 1,5 л/т в 2020 году это количество больше, чем в 2021 и 2022 гг. Так же достаточно заметно снижение количества микроорганизмов в кишечнике трипсов при применении химических препаратов.
В таблице 4 представлены данные по видовому составу микрофлоры кишечника пшеничного трипса.
|
Вариант |
2020 г. |
2021 г. |
2022 г. |
|||
|
виды бактерий |
кол-во, КОЕ х104/100 мг материала |
виды бактерий |
кол-во, КОЕ х104/100 мг материала |
виды бактерий |
кол-во, КОЕ х104/100 мг материала |
|
|
Контроль (без обработки)
|
Enterobacter sp |
0,08±0,02 |
Enterobacter sp |
0,08±0,01 |
Enterobacter sp |
<0,01 |
|
Pantoea sp. |
1,72±0,41 |
Pantoea sp. |
1,92±0,12 |
Pantoea sp. |
0,52±0,02 |
|
|
Klebsiella sp |
<0,01 |
Klebsiella sp |
<0,01 |
Klebsiella sp
|
1,25±0,50 |
|
|
Bacillus toyonensis |
0,26±0,02 |
|||||
|
Обработка семян PS 17 0,5 л/т + опрыскивание растений PS 17 0,5 л/га
|
Bacillus sp
|
0,54±0,02
|
Bacillus sp
|
0,60±0,04
|
Bacillus sp
|
0,30±0,01
|
|
Clostridium sp |
0,25±0,05 |
|||||
|
Pantoea agglomerans |
0,36±0,09 |
Pantoea agglomerans |
0,50±0,03 |
Pantoea agglomerans |
1,56±0,05 |
|
|
Citrobacter sp.
|
0,02±0,01 |
|||||
|
Обработка семян PS 17 1,0 л/т + опрыскивание растений PS 17 1,0 л/га
|
Bacillus sp |
2,30±0,11
|
Bacillus sp |
0,70±0,04
|
Bacillus sp |
0,11±0,01 |
|
Streptomyces sp |
0,03±0,01 |
|||||
|
Pantoea agglomerans |
0,20±0,01 |
Pantoea agglomerans |
0,10±0,01 |
Pantoea agglomerans |
0,45±0,04 |
|
|
Clostridium sp |
0,06±0,01 |
|||||
|
Обработка семян PS 17 1,5 л/т + опрыскивание растений PS 17 1,5 л/га
|
Bacillus sp |
2,96±0,11 |
Bacillus sp |
1,10±0,28 |
Bacillus sp |
0,25±0,09 |
|
Pantoea sp |
0,74±0,05 |
Pantoea sp |
0,60±0,03 |
Pantoea sp |
0,72±0,20 |
|
|
Streptomyces sp |
0,17±0,07 |
|||||
|
Обработка семян RECB-95 1,0 л/т + опрыскивание растений RECB-95 1,0 л/га
|
Bacillus amyloliquefaciens |
3,00±0,01 |
Bacillus amyloliquefaciens |
3,20±0,21 |
Bacillus amyloliquefaciens |
0,67±0,02 |
|
Bacillus toyonensis |
2,00±0,01 |
Bacillus toyonensis |
2,90±0,22 |
Bacillus toyonensis |
0,31±0,01 |
|
|
Хим. препараты («Ламадор 0,15 л/т + «Пропишанс» 0,5 л/га) |
-* |
-* |
Pantoea agglomerans |
0,69±0,11 |
Pantoea agglomerans |
0,46±0,01 |
|
Pseudomonas syringae |
0,42±0,07 |
Pseudomonas syringae |
0,28±0,02 |
|||
|
Pantoea stewartii |
0,39±0,11 |
Pantoea stewartii |
0,26±0,07 |
|||
* вариант обработки не применялся в 2020 году
Видовой состав кишечной микрофлоры трипсов несколько разнообразнее, чем у блошек. Кроме Bacillus spp., Pantoea spp. и представителей рода Pseudomonas, здесь также отмечены представители родов Enterobacter, Klebsiella, Clostridium и Citrobacter, часто входящие в состав кишечной микрофлоры насекомых, а также, представители рода Streptomyces.
Представители рода Pantoea являются преобладающими в контрольном варианте. При применении препаратов их численность снижается, в особенности в случае применения штамма RECB-95. В этом варианте, Pantoea spp. отсутствуют, а вся микрофлора представлена лишь родом Bacillus.
